Summary
이 문서는 뇌의 노화 및 알츠하이머 질환 같은 나이와 관련된 neurodegenerative 질병와 관련된 시냅스 변경의 연구를위한 유전자 변형 쥐 및 생쥐에서 hippocampal 조각 준비 절차를 설명합니다.
Abstract
쥐 hippocampal 슬라이스 준비 아마 포유류의 시냅스 기능과 소성 조사를위한 가장 광범위하게 사용되는 도구입니다. 해마는 쥐와 생쥐에서 빠르고 쉽게 추출하여 슬라이스는 산소 인공 뇌척수의 시간 동안 가능한 유지하실 수 있습니다. 또한, 기본 electrophysisologic 기술은 쉽게 hippocampal 조각의 시냅스 기능의 조사에 적용하고 인지적 손상에 가장 적합한 생체의 일부를 제공하고 있습니다. hippocampal 슬라이스는 학습과 기억에 관련된 신경 소성 메카니즘 연구 특히 인기가있다. hippocampal 조각 (또는 부족 그것의)에서 시냅스 효능의 장기 potentiation과 우울증 (LTP와 LTD)의 유도에 변경이 자주 cognitively 장애인 동물 및 / neurologic 표현형을 설명하기 위해 또는 행동의 메커니즘을 평가하는 데 사용됩니다 nootropic 화합물. 이 문서는 우리가 두뇌 노화와 알츠하이머 질환 (AD) 1-3과 관련된 시냅스 변경의 연구를위한 유전자 변형 쥐 및 생쥐에서 hippocampal 조각 준비 사용하는 절차를 설명합니다. 세 쥐 및 광고 모델 마우스의 사용은 그들의 연구에 젊은 쥐 및 / 또는 마우스를 사용하여 익숙한 연구자 도전의 고유한 집합을 표시할 수 있습니다. 세 쥐들이 두뇌 추출 및 / 또는 절개를 지연하고 따라서 시냅스 기능과 소성의 실제 나이 차이를 부정하거나 과장 수있는 젊은 쥐 및 생쥐보다 두꺼운 두개골과 강하다는 결합 조직을 보유하고 있습니다. 노화와 아밀로이드 병리도 다시 physiologic 평가에서 그려진 모든 inferences을 복잡 절개 절차 동안 지속 hippocampal 손상을 더욱 심하게하다 수 있습니다. 여기, 우리는 이러한 문제를 최소화하기 위해 절개 절차 동안 촬영한 단계에 대해 설명합니다. "건강"과 쥐 및 생쥐에서 "건강에 해로운 '조각 인수 시냅스 응답의 예는 물론 대표적인 시냅스 소성 실험으로 제공됩니다. 이러한 동물 모델 (예 : 레코딩 솔루션 구성 요소, 자극 매개 변수)에 시냅스 기능에 다른 방법 론적 요소의 가능한 영향도 설명합니다. 이 문서의 초점은 생리를 슬라이스에 세 쥐와 유전자 변형 마우스, 초보자의 사용에있는 동안 쥐 모델의 다양한 사용하여 자신의 연구를 시작하려면 여기를 충분한 세부 사항을 찾을 수 있어야합니다.
Protocol
1. 준비 얼음처럼 차가운 산소 인공 뇌척수 (ACSF)
- ACSF "+ 무료 칼슘 2"2 L를 준비합니다. 2L Erlenmeyer 플라스크에 멸균 증류수 또는 더블 H 2 O의 약 1.5 L을 추가하고, 저어 플레이트에 적극적으로 저어 시작합니다. 124 NaCl, 2 KCl, 1.25 KH 2 PO 4, 2 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 10 덱스 트로 오스 (표 1 참조) 다음 ACSF 구성 요소 (MM)를 추가합니다. 소주 H 2 O. 2 L의 볼륨을 지참
- 95 % O 5분의 2 %의 CO 2 공기 탱크, 약 20-30 분 적극적으로 산소 ACSF에 부착된 수족관 버블러 및 튜브를 사용하여. 산도를 확인하고, 필요한 경우, NaOH 또는 HCL을 사용하여 7.4을 조절할 수 있습니다.
- , 별도의 Erlenmeyer 플라스크에 산소 칼슘 2 + 무료 ACSF의 750 ML를 붓고 parafilm로 개통을 커버, 20-30 명의 분 ultrafreezer (-80 ° C)로 전송할 수 있습니다. 이 미디어는 두뇌와 급성 hippocampal 조각의 해부에 사용됩니다 *. # 잘 저어, 그리고 95% O 2 / 5% CO 2와 산소를 재개 ACSF의 남은 1.25 L 볼륨 2 MM에게 CaCl 2를 추가합니다. 이 미디어는 해부 후, 그리고 electrophysiologic 음반 중에 조각 perfusing에 대한 뇌 조각을 저장하는 데 사용됩니다.
* 얼음처럼 차가운 칼슘 2 + 무료 미디어가 신진 대사를 느리게하고 해부하는 동안 칼슘 2 + 종속 excitotoxicity을 최소화하는 데 사용됩니다.
칼슘 2 # 변경 + 노화 동안 dysregulation 및 광고 + 종속적인 시냅스 소성 4-9 칼슘 2의 유도에 큰 영향을 줄 수 있습니다. Mg2 + 비율 슬라이스 레코딩 (2,4,10 참조) 중 : (주)에서 연령 차이에 대한 충돌 보고서 + 다른 ACSF 칼슘 2 사용에 일부 기인 수 있습니다. 칼슘이의 중요성은 + 규제 및 ACSF 칼슘 2 + 노화 연구 수준은 토론 섹션에서 더 자세히 언급됩니다. - 칼슘 2 + 무료 ACSF가 중단되는 동안, electrophysiologic 음반 전과하는 동안 뇌 조각의 유지 보수를 위해 보관 챔버를 준비 *. 우리는 모두 네 개인 microchambers을 (그림 2 참조)를 포함하는 사용자 지정 매크로 들고 챔버를 사용합니다. macrochamber는 무균으로 가득합니다, H 2 O는 산소와 microchambers은 기본적으로 물 표면 위에 내다 섬이다. 각 microchamber 내에서 조각은 산소 ACSF의 얕은 수영장에서 netted 삽입에 휴식. 조각이 완전히 가라 앉지만, humidified 공기와 인터페이스에 앉아되지 않습니다. macrochamber 내에서 절연 가열 요소는 온도 조정을 허용합니다.
개최 실을 * 몇몇 종류도 상업적으로 사용할 수 있습니다 (예 : 워너 인스 트루먼 트가 잠수 스타일 "사전 회의소 #은 BSC - PC를 만드는)와 노화와 유전자 변형 마우스 슬라이스 연구에 사용하기에 적합해야합니다. 핀치에서 조각을 위해 유지 수 있습니다 ACSF 가득한 작은 배양 접시에있는 몇 시간. 산소 공급 튜브에 대한 배양 뚜껑에 작은 구멍을 만듭니다. 산소 거품이 물리적으로 조각 선동하지 않도록주의하십시오. 납품 관 단지로 올랐을 경우 슬라이스가 충분한 산소를 얻을 것이다 ACSF 표면 위 (가스 분산은 유체의 표면에 굴곡의 원인이됩니다.)
2. 고령자의 뇌 제거 및 Hippocampal 해부 (> 20 개월 - 쥐)
- 대형 싱크 (그림 1 및 표 2 참조) 옆에있는 해부 영역 *를 준비합니다. 싱크대의 작은 동물 단두대를 삽입하고 접힌 종이 타월을 포함한 뇌 제거 및 hippocampal 해부, 11 # 메스 블레이드, 비비의 가위, 뼈 rongeurs, "해마 도구"(에서 전문 이중 주걱을위한 수술 도구와 자료를 배치 좋은 외과 도구), 작은 수술 가위, 얇은 더블 엔드 주걱, 플라스틱 파스퇴르 피펫, 110mm 직경 왓먼 필터 종이, 얼음으로 가득 lidded 100mm 유리 페트리 접시, 플라스틱 숟가락. 또한 시체의 처리를위한 비닐 봉지가 근처에 보관.
* 브레인 추출 신속하게 가능 한한 완료되어야하므로 정신적 절차 "를 통해 도보로"사용의 순서에 악기를 배치하는 것이 좋습니다. - 냉동고에서 칼슘 2 + - 무료 ACSF를 제거합니다. 미디어 완전히 얼어 있지 부분적으로해야합니다. Parafilm와 커버, 유리 비커에 ACSF의 약 50 ML을 붓고, 그리고 해부 영역 옆에있는 곳입니다. 이것은 미디어가 제거되면 간단히 두뇌를 저장하는 데 사용됩니다. 나머지 칼슘 2 + 무료 미디어 슬라이스 준비 Vibratome에있는 저수지를 채우는 데 사용됩니다. 이 미디어는 reoxygenated, 또는 단순히 parafilm으로 덮여과 4 냉장고에 삽입할 수 있습니다 ° C.
- 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인된 방법을 사용하여 쥐를 안락사. 우리 동물 점차 백퍼센트 CO 2 가득한 작은 플렉시 챔버에 배치됩니다. 의식의 손실은 일반적으로 5 분 내에 발생 반사 활동의 부재에 의해 확인발가락 핀치에 따라.
- 최초의 자궁 경부 척추 바로 주동이의 쥐 목을 벨과 접힌 종이 타월에 머리를 놓으십시오. # 11 메스를 사용하여 신속하게 비골 근처 시작과 후두 골에 caudally 실행 두피의 중앙에 절개를합니다. 완전히 두개골 등의 표면에 봉합을 노출, 피부 근육을 통해 완전히 절단해야합니다.
- 비비 가위로 스컬 번호판으로 잘라. 젊은 쥐 및 생쥐에서 두개골이 신속하게 혼자 뼈 rongeurs의 사용과 제거할 수 있습니다. 그러나, 세 쥐이 절차 어렵게 만들 수 있습니다 젊은 성인 쥐 및 생쥐보다 두꺼운 두개골 있습니다. 우리는 두개골을 통해 절단하는 것은 크게, rongeurs과 뼈 제거를 용이하게 뇌에 부상을 lessens하고, 귀중한 초를 절약할 것으로 나타났습니다. 단단히 카운터 상단에 쥐의 머리와 두개골의 뒷부분 부분에있는 구멍의 매그넘의 우수한 지역에 비비 가위 하단 깎아지른의 최첨단을 놓으십시오. 뒤통수 판을 통해 잘라 두개골의 내부 표면 (그리고 멀리 두뇌에서) *에 대해 단단히 낮은 완전한을 유지하고, 다음 정수리 판의 정중선을 따라 봉합. 당신이 전두엽 두개골 판을 통과하여 갈 때까지 rostrally 진행합니다.
* 그것은 압력이 실수로 계측을 방지하기 위해 멀리 두뇌의 지시는 것을 매우 중요합니다. - 뒤통수, 정수리, 그리고 두뇌의 측두엽 스컬 번호판을 분리합니다. 안정성과 활용을위한 가구로 단단히 머리를 들고 계속하고 두개골의 내부 표면에 대한 왼쪽 정수리 판 유지하는 압력을 받고 rongeurs 하단의 턱을 슬라이드. 다음 함께 rongeurs의 문턱을 당기 두뇌에서 떨어진 두정 골과 후두 접시를 잡아 위쪽 방향과 손목을 롤. 이것은 왼쪽 북반구의 지느러미 표면의 대부분을 노출해야합니다. 필요한 경우,뿐만 아니라 왼쪽 전두엽 플레이트를 제거하는 rongeurs을 사용합니다. 다른 반구에 대해이 과정을 반복합니다. 접시가 전이되면 신속하게 시간적 접시에 붙어 두뇌의 표면에 걸쳐 뻗어 수있는 두라 물질에 대한 검사. 부드럽게 rongeurs와 떨어져 이들을 당기거나 가위로 잘라 거리에 *. 이제 다시 두개골쪽으로 멀리 두뇌에서 압력을 유지, 두뇌와 오른쪽 시간적 판 사이의 rongeurs의 위턱을 밀어. 멀리 두뇌의 측두엽 접시를 당기 비틀림. 이렇게 같이 당신은 "위기"를 듣고 / 느낄 것입니다. 왼쪽에 대해 반복합니다.
* 두라는 동물 transcardially ACSF와 perfused되어 특히, 자리에 어려울 수 있습니다. 그러나 두라가 제거되지 않은 경우, 그들은 현세의 플레이트를 제거하는 레이저와 같은 두뇌 (가장 가능성이 해마)를 통해 슬라이스합니다. 시간적 접시 가까운 거리에 두라을 Snipping하면 머리를 찔러의 가능성을 최소화합니다. - 두뇌의 압축을 풉니다 *. 빨리 칼슘 2 + 무료 ACSF "눈녹은"에서 parafilm를 제거합니다. 그것이 두뇌에 따라 완전히 때까지 이제 두뇌와 하단의 두개골 플레이트의 복부 표면 사이의 Hippocampal 도구의 광범위한 주걱 헤드를 슬라이드. 그대로 두개골 신경을 도려 옆으로 사이드 - 투 - 측면에서 그리고 앞으로 및 뒤로 몇 번 주걱 이동합니다. 지금 칼슘 2 + 무료 ACSF과 parafilm와 커버의 Hippocampal 도구 및 잠수함과 뇌를 후비다. 1 분에 대한 뇌의 진정하자. 이것은 단두대를 청소 시체 처리 및 해부 영역을 재구성하는시기가시기입니다.
단계 2.3-2.7의 경우 *는 속도가 관건입니다. 우리는 30-35 초이 절차를 (잘린에서 ACSF에 잠수 뇌)를 완료하려고합니다. 우리의 경험에서, extractions 특히 노인 쥐 들어, 부정적인 hippocampal 슬라이스의 건강에 영향을 나타나는 이상 분도 세고있다. 다음 절차를 사용하여, 우리는 우리의 연구에 대한 세 젊은 쥐 사이의 추출 시간에 차이를 관찰 없습니다. - hippocampi의 압축을 풉니다. 얼음처럼 차가운 페트리 접시의 뚜껑에있는 왓먼 필터 용지를 삽입하고 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 ACSF와 신문을 저해할. dampened 왓먼 용지에 숟가락과 장소를 사용하여 ACSF에서 머리를 검색할 수 있습니다. 메스 블레이드를 사용하여 주동이의 이마 엽 (叶)의 소뇌와 약 분기 제거합니다. 완전히 두 반구를 분리 intrahemispheric 균열 (fissure)를 통해 메스 칼날을 실행합니다. 장소 다시 ACSF 눈녹은와 하나의 반구 "서"는 전두엽의 코로나 비행기가 아래로 향하게되어 같은 해부 무대에서 다른 백업하십시오. 당신은 명확하게 뇌간과 overlying의 피질 (잿빛 / 핑크있는)에서 중간 머리를 (어느 흰색)을 구별할 수 있어야합니다. midbrain에 뛰어난와 하부 colliculi을 찾아,이 두 가지 흰색 "손잡이"와 같은 모양이 방향에있는 두뇌의 "가기"에있을 것입니다. 외과 가위를 사용하여, 부드럽게 제자리에 midbrain을 보유하고있을 격차의 무게 주걱을 슬라이드트윈 colliculi과 네크로 텍스. 아주 부드럽게, 주걱을 슬라이드에 계속 brainstem / midbrain / 거리 측면 뇌실과 해마의 내측 표면의 내부를 공개 시상을 가져옵니다. 부드럽게 fornix을 도려 주걱의 날카로운 가장자리를 사용하여, 흰 섬유 번들은 해마의 앞쪽에 / 지느러미 부분에 위치하고 있습니다. 가위로 조심스럽게 완전히 두뇌의 나머지 부분에서 severing없이 brainstem / midbrain / 거리 시상을 당겨 계속. 말머리 피질 이제 brainstem에서 자유롭게 누워서한다 *. 그것이 화살 섹션 (마이너스 시상) 것처럼 당신이 중간 해마와 overlying의 피질보고되도록 다음 해부 무대를 켜십시오. 이제이 비행기에있는 해마의 하단에있는 얕은 쌍곡선을 형성 흰색 fimbria 섬유가 나타납니다. 피질에서 별도로 해마를 돕기 위해 fimbria 아래의 격차에 플라스틱 전송 피펫, 부드럽게 물총 일부 ACSF을 사용합니다. 부드럽게이 간격에 주걱을 슬라이드, 등 주걱의 긴 측면은 해마의 긴 축과 평행하게 실행. 주걱은 해마에 따라 완전히되면, 가위로 단단히 brainstem / midbrain / 시상을 누른 실제로 두뇌의 나머지 부분에서 해마를 분리하여 신체에서 멀리 주걱을 롤. 해마 무료되면, 부드럽게 남아있는 피질, 혈관, 흰색 물질을 멀리 트림. 해부 무대의 반대편에 ACSF 눈녹은의 작은 금액을 특종. 부드럽게 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 ACSF 몇 밀리리터와 윤활유 및 꺼 옆에있는 해마의 위치. 다음, 다른 반구를 제거하고 절개를 반복합니다.
* 당신은 brainstem에서 피질의 분리를 방지 추가 결합 조직, 흰 문제, 또는 vasculature 떠나 건방진하기 위해 가위를 할 수 있습니다. 당신의 가위의 포인트는 해마에 아주 가까이되므로 매우 정확한 자르는을 (날카로운 가위가 있어야됩니다) 전달해야합니다.
3. 지드 트렌스 제닉 마우스의 뇌 제거 및 Hippocampal 해부
- 안락사와 목을 벨 마우스 및 섹션 2.3에서 설명한대로 두피에 정중선 절개를합니다. 마우스 크게 두뇌 추출을 단순화 쥐보다 더 얇은 두개골 있습니다. 가위로 머리를 잘랐다 그러므로 필요가 없습니다. 거리에 뒤통수, 정수리와 관자놀이 두개골 플레이트를 잡아 작은 문턱 (표 2)와 뼈 rongeurs을 사용합니다. 쥐와 마찬가지로, 제어 동작을 사용하고 번호판을 제거로 단단히 머리에서 떨어져 두개골의 내부 표면에 rongeurs의 아래턱을 뽑아 내서, 기억나요. 접시가 제거되면, 남은 두개골 신경을 끊는 얼음처럼 차가운 칼슘 2 + 무료 ACSF에 머리를 특종으로 Hippocampal 도구의 좁은 엔드를 사용합니다.
- 뇌의 슬라이스를 준비합니다. hippocampi을 해부하고 마우스 두뇌의 작은 크기로 인해 쥐가를 사용할 때보다 (확실히 해드리겠습니다하지만) 좀 더 도전하실 수 있습니다. 그래서, 일을 더 쉽게 만들고, 우리는 소뇌와 전두엽 엽 (叶)의 주동이의 도움말을 제거하지만 hippocampi을 해부하다하지 않습니다. 대신, 뇌 반구는 신체 메스 블레이드로 구분하고 (아래 제 4 참조) Vibratome의 sectioning 위해 그대로 남아 있습니다.
4. 섹션 두뇌 진동 마이크로톰 (Vibratome)를 사용하여 조각으로 조직과 지주 상공 회의소 *로 전송
- 절삭 무대와 블레이드가 완전히 가라 앉하는 등 얼음처럼 차가운 칼슘 2 + 무료 ACSF과 Vibratome의 저수지 채우십시오. 쥐 조각을 만들기위한, 메스 블레이드 각 해마의 주동이의와 꼬리 도움말을 잘라. 이러한 감축은 수직으로 두 개의 열과 같은 밀접하게 함께 hippocampi 위치를하실 수 있습니다. 각 해마의 이가있는 이랑이 서로 마주하고 CA3 지역이 같은 방향으로 지향하는 경우이 최상의 상태로 작동합니다. 마우스 조각을 만들기위한, 수직 이마 엽 (叶)이 아래로 향하게와 긴밀히 함께 각 반구를 위치. 마운트 블록과 Vibratome의 sectioning 무대에 전송에 글루 뇌 조직. 우리는 일반적으로 시냅스 생리학의 실험 ~ 400, 음 섹션을 준비합니다. 형광 이미징가 (CA 2의 예 조사가 + 레벨 및 과도) 실시 될 수 얇은 부분이 준비되어야합니다. 넓은 입을 피펫 또는 # 페인트 브러쉬로 조각을 수집하고 얼음처럼 차가운 칼슘 2 + 무료 ACSF를 포함하는 작은 페트리 접시에 전송할 수 있습니다.
* 슬라이스의 상단과 하단 표면에 Vibratome 최소화 피해 사용하고 확실히 슬라이스 표면 (예 : 전압 클램프 및 CA 2 + 이미징 연구) 근처 세포의 분석을 필요로하는 공부를 권장합니다. 그러나, 더 싼 대안이 가능하며 세포 생리학 실험에 대한 슬라이스를 생성에 적합합니다. 우리는 작은 중력 제어 헬리콥터 2,11 좋은 성공 맥일웨인 조직 초퍼 12를 사용했습니다. 생에 대한S 절차 hippocampi는 수직 헬기가 함께 개최하고 sectioned에 표시됩니다. 브러쉬는 얼음처럼 차가운 칼슘 2 + 무료 ACSF 가득한 작은 지주 요리에 조각 (한 번에 하나씩) 전송하는 데 사용됩니다. 이 방법과 함께 한 문제는 hippocampi가 고르지 섹션에 결과 갈비 사이를 이동할 수있다는 것입니다. 또한, 많은 흰색의 문제로, 특히 자르고하기 전에 가능한 많은 vasculature로 제거하는주의하십시오. 이 자료는 브러시, 면도날, 또는 슬라이스 전송이 매우 어려운 결정과 조직을 스트레칭이나 손상의 확률을 증가 모두에 충실합니다.
브러시를 사용하는 # 경우, bristles에 걸쳐 슬라이스 길이 - 현명한 휴식하려고합니다. 브러쉬 팁 주변의 슬라이스를 포장하는 것은 불필요한 조직은 스트레칭의 원인이 될 수 있습니다. - 그들이 산소 칼슘 2 + 함유 ACSF 목욕을하는 지주 실로 뇌 조각을 전송합니다. 점차적으로 32 ° C (1 ° 매 5 분)로 27 °에서 챔버 온도를 가지고. 슬라이스가 electrophysiologic 실험을하기 전에 1-1.5 H에 대한 부화 수 있습니다.
5. CA3 - CA1 시냅틱 응답을 이끌어 및 기록
- 자극, 녹음 및 접지 전극,, 재관류 시스템,,> 4X 배율 기능이있는 현미경 기록 챔버 매크로와 micromanipulators, 단단한 진동 방지 : 급성 조각의 기본 세포 녹음 들어, 전기 생리학의 역 *를 포함해야합니다 테이블 상단과 패러데이 케이지, 자극기, 증폭기 및 아날로그 - 디지털 (A / D) 변환기, 적절한 수집 소프트웨어와 개인 PC, 오실로 스코프 (선호).
* 과학 커 인스 트루먼 트의 기본적인 슬라이스 전기 생리학 실험의 다양한 수행을위한 환상적이고 저렴한 전기 생리학 시스템 (즉, 커 조직 녹화 시스템)을 제공합니다. 이 시스템은 소형 풋프린트, 휴대용 stimulators 및 증폭기를 가지고 있으며, 부피가 큰 패러데이 새장 필요없이 실험실 - 벤치 표준을 사용할 수 있습니다.
물론, 뇌 조각은 또한 추가적인 장비 및 자료를 요구할 것입니다 수많은 정교한 electrophysiologic 및 이미징 기술을 수행하기위한 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 주요 전기 생리학 역 빠른 전압 및 전류 클램프 기능, 형광등 조명 시스템 및 디지털 카메라와 증폭기가 포함되어 있습니다. 이 스테이션은 뇌 조각뿐만 아니라, 패치 - 클램프 녹음과 조각과 셀 문화 3,12,13에 형광 이미징에서 세포외 필드 레코딩에 사용됩니다. 장비와 구성 요소의 전체 목록에 대한 표 3을 참조하십시오. - 넓은 입을 피펫 또는 작은 페인트 브러쉬를 사용하여, *는 자극 / 레코딩하기 전에 10-15 분 순응 수 있도록 기록 챔버에 하나 이상의 슬라이스를 전송합니다. 우리의 연구, 조각은 (그림 3 참조) 워너 계측기하여 RC - 22 챔버에 삽입 그물에 ACSF과 휴식에 빠져들 수 있습니다. ACSF는 흐름 속도를 조정하는 레귤레이터를 통해 중력 - 공급되며, 32 prewarmed ° C 녹음 챔버에 도달하기 전에 인라인 마이크로 히터에 의해. 중앙 진공 라인은 ASCF를 제거하는 데 사용됩니다.
잠수정 및 인터페이스 스타일 녹화 실을 * 많은 종류가 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리는 조각 (즉 슬라이스가 humidified 공기와 ACSF와 인터페이스에 앉아) 인터페이스 챔버에서 2,11를보다 강력한 시냅스 답변을 전시 것을 관찰했습니다. 그러나, responsivity은 조각이 ACSF에 빠져들 때 일반적으로 더 안정됩니다. 마약 재관류는 잠수 실에서 또한 더 효율적입니다. - 위치는 자극과 전극을 기록. 자극기이나 자극 아이 솔 레이터는 켜져 있지만, 출력은 위치 CA3 CA2 국경 근처의 지층 radiatum 지역 (그림 4 참조)에서 슬라이스를 통해 자극 전극을 0으로 내려 걸었와 함께. 우리는 CA3 샤퍼 부수 (SC) 섬유에 50-100 우리가 이상 성의 펄스를 제공하기 위해 꼬인 플래티넘 이리듐 와이어를 사용합니다. 플래티넘 이리듐 와이어와 이상 성의 펄스의 사용은 최소화 전극 분극 도움을 줄 수 있습니다. 그냥 슬라이스의 표면을 깨는, CA1 지층 radiatum에 기록 전극을 낮추십시오. 우리의 기록 전극은 ACSF 가득한 유리 micropipette (MΩ ~ 7 팁 저항)에 자세 / AgCl 와이어입니다. 중간 수준 (우리 ~ 150 μA하기 위해 경기 부양 아이 솔 레이터를 설정)로 자극기에 출력을 켜고 자극 펄스를 관리하고 천천히 작은에 자극 전극을 낮은 액슨 인 스트 루먼트 (주)에서 같은 Clampex으로 수집 소프트웨어를 사용하여 활동을 취득 시작 자극 artificact까지 간격이 CA1에 기록됩니다. 다음, 섬유 발리 (FV)와 amplitudes는 (그림 4B 참조) 최대한의 수준에 도달 흥분성의 postsynaptic 잠재적인 (EPSP)까지 CA1 답변을 인수하면서 천천히 간격의 자극과 기록 전극을 모두 낮은 진행합니다.
- 시냅스 강도 곡선을 수립하고 시냅스 소성을 조사. 시냅스 강도 곡선을 생성하기 위해 점점 더 높은 농도와 기록 일에 SC에 자극 펄스를 제공CA1 전자 대응 활동. 사용 자극 강도 수준의 범위와 숫자는 다를 수 있지만 FV 또는 EPSP 값 (그림 5) 중 역모를 꾸몄다 때 sigmoidal 곡선을 생성하기 위해 충분해야합니다. EPSP 슬로프가 monosynaptic CA3 - CA1 전류 오염 측정을 제공하면서 FV 진폭이 활성화 presynaptic 섬유의 비율이 안정적인 측정을 제공합니다. 자극 강도 레벨에 걸쳐 FV에 대한 EPSP 경사를 계획하는 것은 그러므로 활성 afferents의 수를 당 EPSP의 크기를 반영하고 CA3 - CA1 시냅스 강도의 뛰어난 예측을 제공합니다. 일반적으로 시냅스 강도 수준이 크게 예 : 4,14 참조 어린 쥐 및 연령 - 유사한 야생 형 생쥐에 비해 세 쥐와 APP/PS1 생쥐의 CA1 지역에서 감소하고 있습니다.
- 시냅스 강도 곡선 동안 가난한 건강의 흔적 (즉, 최대한의 EPSP의 진폭 <1 MV) 또는 hyperexcitability (예 : 2 개 이상 인구 스파이크의 모양) 표시 슬라이스는 통계 분석 (그림 4C 참조)에서 제외됩니다. 우리는이 조각이 거의 60 분 기간 및 / 또는 신경 소성의 유도 아래의 높은 변수 응답을 표시에 걸쳐 안정적인 응답을 전시 없다는 것을 발견했다. 그것은 "건강하지 못한 조각"는 기록 챔버로 이송 모든 조각에 불과 10~20%를 만드는 것이 지적 가치가 있어요. 또한, 우리의 경험, 건강에 해로운 슬라이스를 식별의 빈도가 연령, 종 및 유전자형에 걸쳐 매우 유사합니다.
- 조각의 장기 potentiation (LTP) 또는 장기 우울증 (주)를 유발. LTP와 LTD는 시냅스 활성화의 다양한 패턴에 대응 시냅스 기능에 지속적인 증가 (LTP)와 감소 (주)입니다. 두 프로세스는 널리 학습과 memory15에 대한 중요한 메커니즘을 반영하고 신경 장애 및 / 세포 메커니즘을 조사 또는 메모리 적자와 neurodegeneration 16 ameliorating위한 pharmacologic 전략을 평가하는 데 유용 성과 대책을 제공하기 위해 생각하고 있습니다.
시냅스 소성 실험을위한 1 MV의 * 모든 조각에 대한 자극 강도를 재설정하고 0.033 Hz의 주파수에서 기준 자극을 시작합니다. EPSP 슬로프 값은 LTP 또는 회사의 유도하기 전에 최소한 20 분 안정되어야합니다. 밀접하게이 시간 동안 EPSPs을 모니터하고 기울기가 10 분의 1 이상 변동하고 새 기준을 시작할 경우 자극 강도를 재설정하십시오. 모든 200 MS 부여 100 Hz에서 100 Hz에서 자극의 자극 또는 여러 짧은 파열 (~ 10 펄스)의 일초 기차를 이용하여 LTP를 유발. LTD 유도의 경우, 1 Hz의 속도로 900 자극 펄스를 제공합니다. LTP 또는 LTD의 유도 후, 추가로 60 분 이상 신경 반응을 수집합니다. 이전과 낮은 / 고주파 자극 후 60 분 얻은 EPSP 슬로프 값은 LTP 또는 회사의 존재를 확인하기 위해 비교됩니다.
세 쥐와 APP/PS1 마우스는 결함 LTP 및 향상된 회사를 (그림 5 참조) 표시하는 경향이 있으며 이러한 변화는이 동물 모델 6,16의 장애인 인식에 기여하는 제안되었습니다. 그러나, APP/PS1 마우스와는 달리, 세 쥐의 LTP / LTD의 변화는 실험실에 걸쳐 변수입니다. , 고령자 쥐가은 일반적으로 "강한"(즉, 100 Hz에서) 자극에 대한 응답으로 성인에 비해 유사한 LTP 수준을 전시 있지만, milder 자극의 매개 변수가 사용되는 표시 결손 (낮은 자극 주파수 이하 자극 펄스를 즉 () 검토를 위해 4,6를 참조하십시오 16). 다른 그룹들이 세 동물에 차이 또는 감소 느끼기 쉬운 상태를 발견하지 않았 동안 또한, 우리를 포함한 일부 연구소는, 노인 쥐 2,17-19에 LTD 유도로 증가 자화율을 관찰했습니다. 으로 (토론 참조)이 간략하게 아래에 설명되어, 실험 프로토콜의 미묘한 그러나 중요한 차이는 이러한 불일치에 대한 계정 수 있습니다.
* 자극의 강도와 EPSP의 진폭은 LTP 유도에 영향을 미칠 수 있으며 문학에 서로 어긋나는 결과의 중요한 원인일 수 있습니다. 이것은 토론 섹션에서 추가로 간주됩니다.
6. 대표 결과
우리의 작업, 다른 그룹의 작업은, astrocyte 기반 염증 신호의 변화가 트리거 및 / 또는 노화 및 광고 13,20,21 중에 neurologic 장애 하여금 수 있습니다 제안합니다. 최근, 우리는 효능과 중반 이상 APP/PS1 생쥐에서 여러 소설 항염증성 시약의 행동의 메커니즘을 (이 모델의 설명은 22 참조) 조사 종점 조치로 시냅스 강도, LTP와 LTD를 사용 피셔 세가 344 쥐. 아래의 결과는이 문서에서 설명하는 프로토콜을 사용하여 얻은되었습니다.
소설 항염증성 adeno - 관련 우리 연구실이 개발한 바이러스 (AAV) 시약가 (상당히 신경 강도를 증가 (P는 <0.05)과 중반 이상의 LTP의 결손 (P는 <0.05)을 방지하기 위해 파일럿 연구에 표시되었습니다 16 원 - 개월) APP/PS1 마우스 (치료 상태마다 n은 = 4-6 조각). 두 개의 다른 조각, 콜에서 대표 시냅스 강도 곡선과 LTP 실험같은 16 개월 APP/PS1 마우스 ected, 그림 5A - C에 표시됩니다. 다른 슬라이스가 제어 AAV 시약 (제어)로 치료하는 동안 하나의 슬라이스는 (시약) 우리 소설 AAV 대우 북반구에서 추출한했다. LTP 100 Hz에서 자극 (10 초 간격 intertrain)의 두 1 초 열차를 사용하여 두 조각으로 유도했다. - 처리 슬라이스 시약에 대한 시냅스 강도 곡선이 큰 시냅스 강도 지표 제어 슬라이스의 왼쪽으로 이동됩니다. 또한 중간 세 APP/PS1 생쥐에 대한 전형적인, LTP는 제어 슬라이스 (예 : 23)에서 기준을 빠르게 부식하는,합니다. 반대로, LTP 우리 소설 시약 대우 통에 약간 부식하는.
두 번째 최근 연구에서는, 우리는 차량 처리 노인 쥐 (사전 LTD 기준, P <0.05의 85 %)에 상당한 공사를 관찰했다. 대조적으로, 어떤 회사는 소설 안티 - 염증 "약물"(사전 LTD의 기준 97 %, 아니 큰)로 치료 쥐 세 이상에서 관찰되지 않았습니다. 시냅스 강도에 대한 약물 효과는 관찰되지 않았습니다. 이 데이터 세트 (그룹당 n은 = 80-10 쥐)에서 대표 LTD 실험은 그림 5D - F의 그림입니다.
그림 1. 뇌 해부에 사용되는 도구 및 재료., 종이 타월. B, 메스 블레이드. C, 비비 가위. D, 뼈 rongeurs (쥐)을. E, 뼈 rongeurs (마우스 / 쥐를 위해). F, 플라스틱 숟가락. G, 플라스틱 전송 피펫. H, Hippocampal 도구입니다. I, 주걱. J, 외과 가위. K, 유리 페트리 접시.
그림 2. 사용자 뇌 슬라이스는 챔버를 들고. A, macrochamber. B, 뚜껑. C, 다공 실리콘 튜브와 H 2 O 저수지. D, microchamber. E, ACSF 전달 튜브 (폴리에틸렌). F, O 2 배달 튜브. G, 온도 제어를위한 포트. H, netted microchamber 삽입.
그림 3. RC22 잠수 챔버. A, 기록 챔버. B, 그라운드 전극. C, 흡인 바늘.
그림 4. Hippocampal 슬라이스 그림과 세포외 파형. 전기 생리학 실험에 사용되는 트랜스 hippocampal 섹션 A, 만화. CA = 코누 Ammonis. DG는 = 이가있는 이랑. SC = 샤퍼 민간인 피해. S radiatum = 지층 radiatum. B는, SC (CA3 축삭 넓이)의 전기 자극은 자극 유물을 elicits, presynaptic 인구 스파이크, 또는 섬유 발리 (FV)에 의해 거의 즉시 따라갔다. FV의 진폭이 활성화 SC 섬유의 수를 직접 비례합니다. 현장 흥분성의 postsynaptic 잠재적인 (EPSP)의 부정적인 진행 단계의 경사가 SC 터미널에서 릴리스를 조미료에 대한 응답으로 CA1 피라미드 뉴런의 시냅스 전류를 depolarizing의 활성화에 직접 해당합니다. "건강"(왼쪽 패널)의 9 가지 자극 강도 수준 (30-500 μA)에 대한 응답으로 CA1 지층 radiatum에 기록된 C, 중복 대표 세포 파형, "건강에 해로운"및 "hyperexcitable"조각. 다섯 파형은 레벨 당 평균되었습니다. 건강한 조각이 자극 범위에 걸쳐 동적으로 대응하고 하나의 긍정적인 지속적 인구 증가 (CA1의 연결 방전을 반영) 높은 자극 수준을 나타냅니다. RC22 잠수 챔버에서 최대한 EPSPs는 일반적으로 1.5에서 진폭 3 뮤직 비디오까지 다양합니다. 건강에 해로운 조각 (중간 패널)은 종종 큰 FV, 그러나 작은 최대한의 EPSP를 (<1 MV) 전시 및 일반적으로 가난한 소성을 보여줍니다. Hyperexcitable 슬라이스 (오른쪽 패널)은 EPSP의 오름차순 사지에서 두 개 이상의 재생 인구 스파이크를 보여줍니다. hyperexcitable 조각에 답변 종종 불안 정한하고 variably 회사 / LTP 자극에 의해 영향을받습니다.
그림 5. 대표 전기 생리학의 실험 (16 MOS) 중간 세 APP/PS1 마우스 및 피셔 344 쥐 (22 MOS) 이상에서 급성 슬라이스에서 수행. 패널 AB 쇼 데이터 컨트롤 adeno - 관련 (AAV) 바이러스로 치료 APP/PS1 마우스에서 수집한 건설 (제어) 또는 소설 AAV 시약 (시약) 우리 연구실 그룹에 의해 개발되었습니다. 큰 시냅스 강도 지표 FV 곡선 (A) : 제어 슬라이스로 상대의 슬라이스는 전시에게 시약과 EPSP에 표시된 왼편쪽에 변화를 취급. 시약 - A - 대우 슬라이스 또한, (B) 2 1 초, 100 Hz에서 자극 열차의 전달 후 견고하고 안정적인 LTP를 표시하는 동안이 동물 모델의 전형적인 제어 슬라이스는 전시 결함 LTP를. 패널은 차량이나 소설 안티 - 염증 약물 (마약)의 만성 (4 주) intrahippocampal perfusions을받은 두 개인 세 쥐에서 수집한 데이터를 표시 DF. 기초 시냅스 강도는 약물 치료에 의해 상대적으로 영향을받지되었습니다(D). 그러나, 약물은 (주) (E)의 유도 방지에 매우 효과적이었습니다. 패널 C와 F 쇼 대표 EPSP하기 전에 각각의 조각에서 기록된 파형 (예정) 후 60 분 (POST) LTP / LTD 자극의 전달. 자극 아티팩트가 표시되지 않습니다.
Discussion
이 프로토콜에 제시된 단계는 뇌의 해부가 젊은 성인 쥐처럼, 노인 최소한으로 신속하게 효율적으로 수행하는 보험에 가입하는 데 도움이됩니다. 우리는 또한 LTP와 LTD에 자신의 슬라이스 연구를 설정하는 초보자를위한 충분한 세부 사항을 제공합니다. 노화와 신경 기능과 소성의 광고 변경 추가 탐사가 귀하의 목표 중 하나가있다면, 더 배려를받을 자격이 상기에 언급한 건 요즘 적어도 두 개의 다른 방법 론적 문제가있다. 첫째, 여러 실험실 보여주 그 칼슘 2 + : Mg2 ACSF가 hippocampal 조각 2,10,24,25의 유도 시냅스 소성에 표시된 영향을 미칠 수있는 기록에 + 비율. 포유류의 CSF에서 CA 2 + : Mg2 + 비율이 약 (예 : 26를 참조)입니다. 그러나, ACSF 칼슘 2 + : Mg2 + 가까이 2 비율이 일반적으로 시냅스 기능과 소성의 슬라이스 연구에 사용됩니다. 초기 연구에서는 이러한 행위는 아마 LTP의 유도를 최적화하기 위해 적응되었다, 그때 이후 모든 소성 연구를위한 루틴이되었습니다. 그러나, 이러한 행위 때문에 칼슘의 연결 2 + 규제에 잘 특징 차이 고령화 및 광고 연구에 문제가있을 수 있습니다. 특히, CA 2 + 유입 및 / 또는 칼슘 2 + 유도된 칼슘 2 + - 릴리스의 연결을 활성화 3,27-31 동안 세 쥐 및 / 또는 광고 모델 마우스에서 고가입니다. LTD의 유도는 ACSF 칼슘 2 + 수준의 미묘한 변화에 특히 민감합니다. Mg2 가까이 두 + 비율이 성인에 강력한 회사를 감찰하러 온 적도에서 : 2mM 칼슘 2 + 2 MM Mg2 +, 노인,하지만이 성인 동물 젊은 없습니다 LTD에서 일반적으로 결과 중에 칼슘 2를 사용하는 연구 +를 사용하여 우리의 프로토콜, 32 세 쥐에서 감소 회사와 함께 나이 차이 2,10 또는 부재. 이러한 관찰은 노인과 젊은 성인 동물 + 종속 소성 칼슘 2 비교하면 조심스럽게 ACSF 칼슘 2 + 및 Mg2 + 수준을 고려하는 필요성을 강조 표시합니다.
두 번째 방법 론적 문제는 postsynaptic 탈분극 33 시냅스 강도 가능 노화 / 유전자형의 차이에 LTP의 강한 의존성에 관한. 전형적인 LTP 실험, 기본 및 LTP의 자극 강도는 일반적으로 반 최대한의 (또는 3 분기 최대한) EPSP 진폭을 생산하도록 조정됩니다. 잠재적인 문제는 세 쥐와 APP/PS1 쥐가 일반적으로베이스 라인 EPSP 가치도 세 쥐와 APP/PS1 생쥐에 작은 것입니다 즉, 자신의 젊은 및 / 또는 야생 타입 대응에 상대적으로 시냅스 강도를 감소 보여주는 것입니다. 작은 EPSPs는 LTP 33 유도를위한 확률 감소의 결과로, LTP의 자극 동안 적은 탈분극로 번역 수도 있습니다. 때문에 잠재적인 혼란, 그것이 동물들이 처리량 적자, 소성 적자 또는 둘 모두를 전시 여부를 확인하기가 어렵습니다. 즉, 세 및 / 또는 APP/PS1 생쥐에서 LTP 유도 메커니즘 (NO 소성 적자) 기능 그대로 수 있지만 충분 이러한 조건 하에서 (처리량 적자) 자극. 처리량 및 소성에 대한 메커니즘에 대한 메커니즘은 특정 pharmacologic 치료에 매우 다르게 반응 수도 있으므로이 구분은 중요합니다. 우리는 이전 LTP의 자극에 대한 모든 조각에 걸쳐 동일한 수준 (예 : 1 MV)로 EPSP 진폭을 정규화하여 LTP 유도에 감소 처리량의 영향을 최소화하려고합니다. 다른 전략뿐만 아니라 효과 (LTP의 자극 동안 그룹 전체의 막 잠재력을 맞춰야 전압 또는 전류 클램프의 예 사용), 이러한 동물 모델에서 LTP를 조사 때 고려해야 수 있습니다.
Disclosures
이 비디오 문서의 생산은 Leica Microsystems에 의해 후원되었다.
Acknowledgments
NIH 그랜트 AG027297, 켄터키 척수 및 머리 부상 연구 신뢰에서 수상하고, 클레 버그 재단의 선물에 의해 지원 작동합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| KH2PO4 (monobasic) | Sigma-Aldrich | P5379-100G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
| CaCl2 (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3306-250G | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | |
| C6H12O6 (dextrose) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| Table 1. Reagents required | |||
| Erlenmeyer Flasks | Fisher Scientific | FB-500-2000 FB-500-1000 | |
| Aquarium Bubbler | Used for oxygenating media. Available at most pet stores | ||
| 50 mL Glass beaker | Fisher Scientific | 02-540G | For brain storarge in ACSF |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Small Animal Guillotine | World Precision Instruments, Inc. | DCAP-M | |
| Flat paper towel | |||
| #11 Feather surgical blade | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| Beebee bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Lempert Rongeurs | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8321 | Use for rats |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16020-14 | Use for mice or rats |
| Hippocampus tool | Fine Science Tools | 10099-15 | |
| Spoon | A plastic teaspoon will do | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | Spatula |
| Surgical iris scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| plastic transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-43 | |
| 110mm Whatman filter paper | Fisher Scientific | 09-805E | Whatman cat. 1001-110 |
| Glass petri dish | Fisher Scientific | ||
| Leica VT1000P Manual Vibrating Microtome | Vibratome | VT1000P | |
| 0.1mm FA-10 Feather S blade | Ted Pella, Inc. | 121-9 | 0.1mm FA-10 Feather S blade |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (with rubber bulb) | Fisher Scientific | 13-678-20A | For transferring slices: Tip is broken off and heat-polished for larger opening |
| 35 mm Polysterine Culture dish | Corning | 430588 | Used for collecting slices after dissection |
| Table 2. Tools and materials for dissection | |||
| Holding chamber | Custom Made | ||
| P-97 Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday cage | Custom Made | ||
| Pyrex Aspirator Bottle with Bottom Sidearm | Corning | 1220-1L | |
| Gravity-contolled IV set with regulator | Baxter Internationl Inc. | 2C8891 | |
| Central Vacuum Line | Available in most modern labs | ||
| 95% O2 / 5% CO2 Gas Mix | Scott-Gross Co. | ||
| TygonTM Lab tubing For O2/CO2 delivery | Fisher Scientific | Non-toxic, non-oxidizing, comes in a variety of sizes. | |
| Eclipse E600FN Microscope | Nikon Instruments | with 10x and 40x objectives, near infared filter, and GFP,DS-Red2 filters | |
| Cool Snap ES Digital Camera | Photometrics | Cool Snap ES Digital Camera | |
| X-Cite Fluorescent Illuminator | EXFO | X-Cite Fluorescent Illuminator | |
| Microscope Platform | Siskiyou, Inc. | Custom assembled | |
| RC-22 Submersible recording chamber | Warner Instruments | 64-0228 | Requires P-1 platform and stage adaptor (Product # 64-0277 From Warner) |
| TC2BIP 2/3Ch Temperature controller | Cell Microcontrols | ||
| 4 Axis Manual Miniature manipulator | Siskiyou, Inc. | ||
| Platinum Iridium Wire (0.002 in) | World Precision Instruments, Inc. | PTT0203 | |
| A365 Stimulus Isolator | World Precision Instruments, Inc. | A365 Stimulus Isolator | |
| Multiclamp 700b Amplifier | Axon Instruments | ||
| Digidata 1322A A/D converter | Axon Instruments | ||
| PClamp software | Axon Instruments | ||
| Personal Computer (Pentium 4) | Dell | ||
| Table 3. Electrophysiology equipment and materials | |||
References
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