Summary
היכולת לייצר עבור transgenes
Abstract
יצירה של חיות טרנסגניות הוא מנוצל באופן נרחב ב C. elegans המחקר כולל שימוש חלבונים GFP היתוך ללמוד את הרגולציה דפוס הביטוי של גנים של עניין או דור של טיהור זיקה טנדם (TAP) מתויג גרסאות של גנים ספציפיים על מנת להקל הטיהור שלהם. בדרך כלל transgenes נוצרות על ידי הנחת יחצן במעלה הזרם של גן ה-GFP הכתב או cDNA של עניין, ואת זה לעתים קרובות מייצר דפוס הביטוי נציג. אולם, אלמנטים קריטיים של ויסות הגנים, כגון אלמנטים לשלוט באזור מתורגמים של 3 או מקדמי חלופיים, יכול לפספס על ידי גישה זו. יתר על כן רק גרסה אחת אחוי ניתן ללמוד בדרך כלל על ידי אמצעי זה. לעומת זאת, השימוש של תולעת ה-DNA הגנומי נישא על ידי שיבוטים fosmid DNA סביר כוללת את רוב אם לא כל הגורמים המעורבים בוויסות גנים in vivo, אשר מאפשרת יכולת טובה יותר כדי ללכוד את דפוס הביטוי העיתוי אמיתי. כדי להקל על הדור של transgenes באמצעות DNA fosmid, אנו מתארים E. coli מבוסס הליך recombineering להכניס GFP, ברז, תג, או רצפי עניין אחרים לתוך מקום בגן. ההליך עושה שימוש הגן galK כסמן הבחירה הן הצעדים מבחר חיוביים ושליליים recombineering שתוצאתה השגת השינוי הרצוי עם יעילות גבוהה. יתר על כן, פלסמידים המכילים את הגן galK מוקף נשק הומולוגיה ל-GFP נפוצים TAP גנים היתוך זמינים אשר להפחית את העלות של oligos בשיעור של 50% בעת יצירת ה-GFP חלבון TAP או היתוך. פלסמידים אלה משתמשים מוצא שכפול R6K אשר מונע את הצורך לטיהור PCR נרחב של המוצר. לבסוף, אנו גם להפגין טכניקה לשלב את הסמן UNC-119 על לשדרת fosmid המאפשר fosmid להיות מוזרק ישירות לתוך תולעים או מופצצים כדי ליצור חיות טרנסגניות. וידאו זה מדגים את ההליכים הכרוכים יצירת transgene דרך recombineering באמצעות שיטה זו.
Protocol
סקירה
Transgenes רבים השתמשו בדור של מהונדס ג elegans מורכב רצפים מקדם ואולי גן cDNA משובטים לתוך אחד הווקטורים שנוצר על ידי המעבדה של ד"ר אנדי אש 1. בעוד transgenes הללו הם לעתים קרובות מוצלח בכל הקשור לייצור גן עיתונאי ה-GFP או להביע cDNA בדגם הרצוי, transgenes אלה יכולים חוסר היזמים חלופי, משפר אלמנטים, ו (UTR) מתורגם "אזור 3 אלמנטים אשר ממלאים תפקידים חשובים לשלוט של ביטוי גנים in vivo 2. לדוגמה, הן daf-12-1 ו Fah גנים משפר אלמנטים חשובים אשר נמצאים מחוץ של האמרגן הפרוקסימלי שהיו החמיצו האמרגן רק בונה 3,4,5. יתר על כן בונה transgene רבים להשתמש 3'UTR UNC-54 אשר מונע על ידי ויסות הגנים microRNA המתאים 6,7,8. כתוצאה מכך, יצירת transgenes עם חלקים גדולים של הדנ"א הגנומי תולעת יהיה אידיאלי עבור לכידת כל היזמים, וריאנטים אחוי, ועל UTR '3 אלמנטים שליטה. לאחרונה ג elegans ספריה fosmid המורכב ~ 40 kb אזורים של הדנ"א הגנומי ומכסה כמעט את כל הגנום נבנה. השימוש של הדנ"א הגנומי תולעת נישא על ידי התוצאות הללו שיבוטים fosmid DNA ביכולת גדולה יותר כדי ללכוד את דפוס הביטוי העיתוי אמיתי של גנים ספציפיים 2,8,9,10,11.
עם זאת, בעבודה עם אזורים גדולים של הדנ"א הגנומי מציבה אתגרים מעשיים כגון הקשיים הגדולים בשימוש סטנדרטי טכניקות הביולוגיה המולקולרית 12. כדי להתגבר על המגבלות האלה, טכניקות לשנות fosmids או כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי באמצעות רקומבינציה הומולוגיים ב E. coli פותחו מכונים recombineering 12,13. Recombineering מאפשר הכניסה חלקה של ה-GFP, טיהור זיקה טנדם (TAP), תג, או רצפי עניין אחרים לתוך מקום בגן המבוצע על ידי ג elegans fosmid שיבוט 2,10,14. הומולוגיים רקומבינציה מתרחשת בין מוצר ה-PCR מוקף 50 אזורים bp של הומולוגיה לאתר היעד ה-DNA היעד E. שונה במיוחד coli זנים.
תיארנו לאחרונה הליך דו שלבי עבור שינוי של ג elegans fosmids ידי recombineering הכוללת החדרת הגן galK במיקום הרצוי ולאחר מכן להחליף את הגן הזה עם רצף הרצוי 2. הגן galK משמש כסמן מבחר יעיל הן שלבים בתהליך כפי שהוא ניתן לבחור בעד ונגד באמצעות שימוש במדיום צמיחה סלקטיבית 15. בשלב הראשון של שינוי fosmid, הגן galK מוכנס דרך רקומבינציה הומולוגיים במיקום הרצוי, ואת fosmids שונה זיהו לפי בחירה חיובית היכולת לנצל גלקטוז כמקור פחמן 2,15. בשלב השני, הגן galK מוחלפת רצף הרצוי fosmids שונה נכונה מזוהים באמצעות סלקציה שלילית נגד הגן galK באמצעות שימוש deoxygalactose רעילים נגזרת גלקטוז אשר הורגת חיידקים galK + 2,15. היתרון של galK הוא היכולת של גן יחיד כדי לשמש את הצעדים מבחר חיוביות ושליליות, במקום סמנים אחרים שיש להם גנים נפרדים עבור כל שלב, ואת התוצאות להשיג את השינוי הרצוי עם יעילות גבוהה 2,15.
כדי להקל את היישום של טכניקה זו על C. elegans מחקר, עשינו מספר שינויים המשאבים הזמינים. ראשית, את תגי ה-GFP ו TAP משמשים בדרך כלל כדי ליצור transgenes תולעת, אז אנחנו נבנה בשנת 50 אזורים bp של הומולוגיה לכל אחד התגים האלה לתוך pMOD4 galK-G ו-GT pMOD4 galK פלסמידים אשר משמשים כמקור של הגן galK 2. אזורים אלה מאפשרים בקבוצה אחת של oligos לשמש הן שלבי השינוי fosmid אשר חוסך את הצורך להורות על הסט השני של oligos יקר במקצת. שנית, פלסמידים אלו להשתמש מוצא שכפול R6K אשר מונע את הצורך לעכל ההורה או פלסמיד נרחב טיהור PCR מוצר כמו ההורה הפלסמיד אינו מסוגל לשכפל את החיידקים המשמשים recombineering, והוא יכול רק לשכפל זנים מיוחדים כגון EC100 2 , 16 (טבלה 1 טבלה 2). לבסוף, דרך מקובלת של יצירת מהונדס ג elegans היא באמצעות הפגזה biolistic ואחריו מבחר של תולעים מהונדס דרך להציל את המוטציה UNC-119 17. כדי להפוך את fosmids תואם הפגזה, פיתחנו את UNC-119 pLoxP פלסמיד אשר ניתן להשתמש בהם כדי לשלב את הסמן UNC-119 על לשדרת fosmid 2.
I. אוליגו עיצוב
עם recombineering רצפים הרצוי יכול להיות מוכנס בכל אתר בתוך הגן. אתרים נפוצים הם ב 'בסוף או 3' 5 בסוף בהתאם תחומים פונקציונליים, וריאנטים אחוי, או שלאחר translational שינויים כגון מחשוף על ידי פרוטאזות. GFP pMOD4 פלסמיד נוצר על ידי המעבדה שלנו יכול לשמש כדי להוסיף הדגל מתויג GFP בכל אתר כמו הפלסמיד כולל קודון יוזם וחסר קודון עצירה '3 (איור 1). לעומת זאת, תג TAP יש גרסאות ספציפיות עבור 5 'ו 3' fusions עקב מחשוף TeV שימוש במהלך טיהור 18,19.
- תכנית האתר של הכניסה תג בתוך הגן. קחו מקדמי חלופי, תחומים פונקציונליים, חלופה חיתוך, ופוסט translational שינויים כאשר בוחנים את אתר הכנסת. הכניסה לאתרים שונים יכול לשמש כדי לתייג כל אחד, או כמה isoforms של גן מסוים. זיהוי אזורים 50 נ"ב במורד הזרם של נקודת ההכנסה.
- עיצוב oligos (טבלה 1). או בהיקף 100 ננומטר - ג'ל oligos מטוהרים או oligos Ultramer מ טכנולוגיות DNA משולב יכול לשמש ההליך.
כדי לבצע recombineering galK, אתה צריך לתכנן primers galK עם הומולוגיה bp 50 לאזור איגוף את האתר הרצוי כדי להיות משונות סוף '3 של primers אלה נקלטות על הקלטת galK, אשר שוהה גם pMOD4 galK-G ו pMOD4 galK-GT (איור 1). אוליגו קדימה תהיה 5'------- 50 הומולוגיה נ"ב ------- CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3 "ואת אחד הפוכה כמו 5'------- 50 הומולוגיה נ"ב על גדיל משלים - ------ TCAGCACTGTCCTGCTCCT-3 ".
כדי לבצע recombineering galK עם GFP, אתה צריך לתכנן pMOD4 galK-G או pMOD4 galK-GT primers עם הומולוגיה bp 50 לאזור איגוף את האתר הרצוי להיות שונה (איור 1). הקפד לשמור את החלבון היתוך בתוך מסגרת. ATG יכול להיות מושלך אם תרצה בכך. הסוף '3 של primers אלה נקלטות על ידי אזורים של הומולוגיה GFP איגוף את הקלטת galK. הערה: קודונים הראשון והאחרון של ה-GFP הם קו תחתי כדי להדגים את מסגרת הקריאה. אוליגו קדימה תהיה 5'------- 50 הומולוגיה נ"ב ------- ATG GATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG -3 "3" וזה הפוך 5'------- 50 הומולוגיה נ"ב על המשלים גדיל ------- CAA AGCTTGTGGGCTTTTGTATAG-3 "
כדי לבצע galK C לטווח recombineering TAP, אתה צריך לתכנן pMOD4 galK-GT primers עם הומולוגיה bp 50 לאזור איגוף את האתר הרצוי להיות שונה (איור 1). הקפד לשמור את החלבון היתוך בתוך מסגרת. הסוף '3 של primers אלה נקלטות על ידי אזורים של הומולוגיה TAP איגוף את הקלטת galK. הערה: קודונים הראשונה והאחרונה של TAP מודגשים כדי להדגים את מסגרת הקריאה. אוליגו קדימה תהיה 5'------- 50 הומולוגיה נ"ב ------ ATG GAAAAGAGAAGATGGAAAAAG - -3 'וכן להפך one 5'------- 50 הומולוגיה נ"ב על גדיל משלים - ------ GGT TGACTTCCCCGC -3 "
כדי לבצע galK N לטווח recombineering TAP, אתה צריך לתכנן pMOD4 galK-GT primers עם הומולוגיה bp 50 לאזור איגוף את האתר הרצוי להיות שונה (איור 1). הקפד לשמור את החלבון היתוך בתוך מסגרת. הסוף '3 של primers אלה נקלטות על ידי אזורים של הומולוגיה TAP איגוף את הקלטת galK. הערה: קודונים הראשונה והאחרונה של TAP מודגשים כדי להדגים את מסגרת הקריאה. אוליגו קדימה תהיה 5'------- 50 הומולוגיה נ"ב ------ ATG GCAGGCCTTGCGC - -3 'וכן להפך one 5'------- 50 הומולוגיה נ"ב על גדיל משלים - ------ AAG TGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT -3 " - צור קבוצה של איגוף oligos עבור PCR בצעדים מאוחר יותר כמו גם רצף של fosmid. אלה מקובלים oligos PCR אשר אמור לאגד ~ 100 נ"ב במורד הזרם של אתר הכניסה.
השנייה. העברת Fosmid כדי SW016 חיידקים
Fosmids מן ג elegans fosmid הספרייה ניתנים EPI300 זן חיידקי (F-mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ערה, LEU) 7697 galU galK λ-rpsL nupG trfA אנטונה) (ביוטכנולוגיות Epicentre, מדיסון, WI ) אשר מאפשר את הביטוי fosmid להיות מוגברת מעל בעותק יחיד לכל תא כדי לשפר את התשואות DNA במהלך הטיהור (טבלה 2). עבור recombineering, fosmid יהיה צורך להעביר SW106 זן חיידקי (mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) ΔlacX74 deoR endA1 araD139 Δ (ערה, LEU) 7697 rpsL recA1 nupG φ80dlacZΔM15 [λc1857 (CRO-bioA) <> ט ] (CRO-bioA) <> araC-PBAD Cre ΔgalK) (NCI-פרדריק) זן אשר נושאת את λred גנים הומולוגיים רקומבינציה תחת שליטתו של λ טמפרטורה רגיש repressor ו cre ועין מתנהלת arabinose recombinase (טבלה 2) 15.
- הצו fosmid שיבוט של ג'ין עניין (GOI) מ GeneService (קיימברידג', אנגליה) באמצעות WormbASE כמדריך. בעת בחירת שיבוטים, אנו בוחרים אלה שיש להם את GOI במרכז הרצף. אלה כוללים גנים שכנים עדיף אבל יכול להיות קשה למצוא.
- תרבות שיבוט fosmid של GOI ב LB המכיל 12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol על 37 ° C.
- לגדול תרבות לילה 1.5 מ"ל של fosmid, ומיני מכין את ה-DNA fosmid באמצעות fosmid Epicentre ערכת הכנה (ביוטכנולוגיות Epicentre, מדיסון, ויסקונסין). אנו עוקבים אחר פרוטוקול חלופי המתואר ההוראות הכוללת הוספת לערבב Riboshredder בשלב מוקדם יותר.
- קבע את ריכוז ה-DNA fosmid עם ספקטרופוטומטר.
- הכן את electrocompetent SW106 תאים על ידי גידול תרבות 5 מ"ל לילה של SW106 בצינור Snap-כובע עם 14 מ"ל מרק LB עם chloramphenicol מיקרוגרם / מ"ל 12.5 בשעה 32 ° C.
- לחסן 1 מ"ל לתוך 100 מ"ל של LB עם chloramphenicol בבקבוק 2 ליטר. לגדול SW106 חיידקים 600 OD 0.6-0.8. אין לחמם הלם.
- גלולה ידי צנטריפוגה ב 5000xg במשך 5 דקות, resuspend גלולה ידי vortexing עדינה, ולהוסיף 50 מ"ל קר כקרח גליצרול 10%. חזור על שלב זה לשטוף פעם.
- גלולה SW106 ידי צנטריפוגה ואת לשאוב אבל כל ~ 500 μl של כל supernatant
- Resuspend את כדורי ידי vortexing עדין. הקפאת 100 aliquots μl בחנקן נוזלי או על קרח יבש, ולאחסן בבית -80 ° C לשימוש עתידי.
- המרה את ה-DNA fosmid לתוך תאים SW106 electrocompetent ידי electroporating את החיידקים עם 50 ~ ng של DNA fosmid באמצעות electroporator 2510 Eppendorf ב 1350 ב 0.1 וולט cuvettes הפער ס"מ.
- שחזור חיידקים LB 1 מ"ל לשעה 1 ב 32 ° C.
- פלייט aliquots על צלחות LB עם chloramphenicol (12.5 מיקרוגרם / מ"ל) ו לדגור על 32 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- בדוק את הנוכחות של GOI על ידי המושבה PCR. לגדול תרבות הלילה 5 מ"ל LB עם 12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol על 32 ° C. הוסף 0.5 μL התרבות לתגובה PCR רגילה עם oligos איגוף, ולהגדיל הראשונית 95 ° C הדגירה עד 5 דקות lyse את החיידקים לפני PCR.
- הכינו מלאי גליצרול לאחסון ארוך טווח.
ג. החדרת גנים galK ידי Recombineering
בשלב הראשון של שינוי fosmid, הגן galK מוכנס לתוך fosmid על ידי רקומבינציה הומולוגיים, ואת fosmids שונה נכונה נבחרים על ידי צמיחה על התקשורת מינימלי המכיל גלקטוז כמקור פחמן יחיד (איור 2 א). SW106 חיידקים גדלים לאט על התקשורת מינימלי 3-5 ימים נדרשים כדי לראות מושבות.
- הכן מגבים צלחות מינימלית התקשורת המכיל גלקטוז 0.2%. מגבים התקשורת מינימלי זמין Teknova Inc (הוליסטר, CA) (קטלוג # M2106), אך לא להשתמש כלל גלוקוז.
מגבים תקשורת מינימלית עם גלקטוז 0.2% (1 ל ')
החיטוי 15 גרם אגר במים 870 מ"ל
מצננים עד 55 מעלות צלזיוס ומוסיפים:100 מ"ל מגבים 10X התקשורת מינימלי 5 מ"ל 0.2 מ"ג / מ"ל d-ביוטין (סטרילי מסונן) 4.5 מ"ל 10 מ"ג / מ"ל L-לאוצין (1%, מחוממת, מקורר אז למטה סטרילי מסונן) 10 מ"ל גלקטוז 20% (autoclaved) 1 מ"ל 12.5 מ"ג / מ"ל Chloramphenicol ב EtOH 2.55 מ"ל 20% NH 4 Cl 10 מ"ל 0.132 M dibasic פוספט אשלגן - PCR להגביר את pMOD4 galK-G או pMOD4 galK-GT קלטות באמצעות primers תוכנן לעיל. השתמשנו Phusion (ניו אינגלנד Biolabs, Ipswich, MA) או GoTaq (Promega, מדיסון, ויסקונסין).
- ג'ל לטהר את הלהקה שהתקבל. לכמת את התשואה על ידי ג'ל או ספקטרופוטומטר Nanodrop. מוצר זה PCR הוא מוכן לשלב 3.14.
- לחסן תרבות הלילה של SW106 התאים המכילים את ה-DNA fosmid ב LB עם 5 מ"ל chloramphenicol (12.5 מיקרוגרם / μL). לגדול ב 32 ° C.
- הגדר רועד אמבט מים 42 ° C כדי חימום עם בקבוק 250 מ"ל סטרילי לבעל. שימוש באמבט מים רועד הוא קריטי להשגת יעילות גבוהה.
- הוסף 1 מ"ל של תרבות לילה 100 מ"ל של LB ו chloramphenicol בבקבוק 2 ליטר. לגדול OD 0.6-0.8. זה בדרך כלל לוקח 3-4 שעות.
- העברת 50 מ"ל של SW106 התאים בקבוק 250 מ"ל ו - חום זעזוע 42 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בדיוק. ב waterbath רועד ב 100 סל"ד השאר את החיידקים הנותרים ב 32 ° C כמו לשלוט uninduced.
- מצננים את החיידקים המושרה ואת uninduced על קרח במשך 10 דקות.
- העברת דגימות שני צינורות צנטריפוגה סטרילית גלולה ב ~ 5000xg במשך 5 דקות.
- יוצקים מעל את כל supernatant ו resuspend גלולה ב גליצרול 1 קר כקרח מ"ל 10% על ידי vortexing עדין (כלומר הגדרת 3-4).
- כאשר resuspended, להוסיף עוד 49 מ"ל קר כקרח גליצרול 10%, ו גלולה דגימות ב ~ 5000XG במשך 5 דקות.
- חזור על שלב 3.9, 3.10, 3.11 ו - שוב.
- הסר את כל supernatant על ידי היפוך הצינורות, ואת resuspend גלולה בנוזל הנותרים (כ 500 μL כל אחד). Aliquot לתוך 100 דגימות μL, הקפאת קרח יבש, ולאחסן ב -80 ° C. אלה הם טובים במשך שבועות עד חודשים. (אנחנו בדרך כלל לעצור כאן ולבצע את electroporation למחרת).
- Electroporate המושרה ואת uninduced SW106 תאים עם 150 ננוגרם של המוצר באמצעות PCR 0.1 הפער cuvettes ס"מ להגדיר Eppendorf 2510 electroporator ב 1350 וולט.
- שחזור החיידקים LB 1 מ"ל צינור 14 מ"ל פלקון. לדגור על 32 מעלות צלזיוס למשך 4.5 שעות.
- גלולה החיידקים microfuge 13,200 סל"ד למשך 15 שניות. חיידקים הם resuspended ב M9 ואז נשטף פעמיים להסיר כל מדיום עשיר (ראה להלן למתכון).
- M9 בינוני (1 L)
- 6g Na 2 HPO 4
- 3g KH 2 PO 4
- 1g NH 4 Cl
- 0.5g NaCl
- דוד לחץ
- לאחר לשטוף את השני, supernatant הוא הסיר את גלולה הוא resuspended ב 1 מ"ל M9 לפני ציפוי דילולים סדרתי M9 (100 μL, 100 μL של לדילול 1:10, ו 100 μL 1:100) על גבי מדיה מגבים מינימלית.
- דגירה 3-5 ימים ב 32 מעלות באינקובטור. הערה: היו סבלניים כמו החיוביים נכון לגדול לאט.
- Streak כמה מושבות על צלחות אינדיקטור MacConkey אגר (BD # 281810) בתוספת גלקטוז 1% ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ"ל. כל המושבות המופיעות לאחר השלב האחרון צריך להיות + galK, אבל על מנת להיפטר galK כל - מזהמים, חשוב לקבל אחד, מושבות ורוד בהיר לפני שתמשיך לשלב השני. GalK - מושבות יהיה לבן / צבע ואת החיידקים + galK יהיה בהיר אדום / ורוד עקב שינוי החומציות הנובעת גלקטוז מותסס לאחר דגירה לילה בשעה 32 ° C.
- פיק מושבה אחת לחסן LB 5 מ"ל + התרבות לילה chloramphenicol לצמיחה ב 32 ° C.
- אישור הכניסה של הגן galK במיקום הנכון באמצעות PCR באמצעות oligos איגוף. הוסף 0.5 μL של התרבות לתגובה PCR תקן ולהגדיל הראשונית 95 ° C הדגירה עד 5 דקות lyse את החיידקים. המוצר צריך להיות PCR upshifted בגודל בשל נוכחותם של הגן galK.
- הכינו מלאי גליצרול לאחסון.
IV. החלפת galK עם רצפים תג על ידי Recombineering
בשלב זה הגן galK מוחלף על ידי רצפי תג הרצוי ואת fosmids שונה נכונה נבחרים על ידי הבחירה נגד הגן galK ידי גלקטוז הרעילים אנלוגי deoxygalactose (כלב) (תרשים 2B).
- הכן מגבים צלחות מינימלי מדיה המכילה deoxygalactose 0.2% (כלב) וגליצרול 0.2%. מגבים התקשורת מינימלי זמין Teknova Inc (הוליסטר, CA) (קטלוג # M2106), אך לא להשתמש כלל גלוקוז.
מגבים תקשורת מינימלית עם כלב 0.2% ו גליצרול (1 L)
החיטוי 15 גרם אגר במים 860 מ"ל
מצננים עד 55 מעלות צלזיוס ומוסיפים:100 מ"ל מגבים 10X התקשורת מינימלי 5 מ"ל 0.2 מ"ג / מ"ל d-ביוטין (סטרילי מסונן) 4.5 מ"ל 10 מ"ג / מ"ל L-לאוצין (1%, מחוממת, מקורר אז למטה סטרילי מסונן) 10 מ"ל Deoxygalactose 20% (סטרילי מסונן) 10 מ"ל גליצרול 20% (autoclaved) 1 מ"ל 12.5 מ"ג / מ"ל Chloramphenicol ב EtOH 2.55 מ"ל 20% NH 4 Cl 10 מ"ל 0.132 M dibasic פוספט אשלגן - PCR להגביר את שברי תג pMOD4 GFP, pBS1761 (N לטווח TAP), או pBS1479 (C לטווח TAP) באמצעות oligos אותה משמש בסיבוב הראשון או בעזרת ה-GFP קצר יותר או ספציפיים TAP oligos (רצפי הפנימי בשלב 1.2 ). אם אתה עושה בונה מרובות, זה שימושי במיוחד להשתמש oligos קצר כמו את אותו מוצר ה-PCR יכול לשמש עבור כל בונה.
- ג'ל לטהר את מוצר ה-PCR למדוד את ריכוז באמצעות ג'ל או לספקטרופוטומטריה.
- צור המושרה ואת uninduced SW106 מוסמכת נושאת את fosmid עם הגן galK מוכנס השלבים הבאים 3.4-3.13 לעיל.
- Electroporate המושרה ואת uninduced SW106 תאים עם נ"ג 100 ~ של המוצר באמצעות PCR 0.1 הפער cuvettes ס"מ להגדיר Eppendorf 2510 electroporator ב 1350 וולט.
- שחזור ב LB 1 מ"ל בשפופרת Snap-כובע 14 מ"ל ו דגירה של 32 ° C שייקר עבור 4.5 שעות.
- לשטוף ו לדלל חיידקים כמו בשלבים 3.16 ו - 3.17. פלייט חיידקים על צלחות מגבים מינימלי מדיה המכילה 0.2% 2-deoxy-גלקטוז (כלב) וגליצרול 0.2%.
- לדגור על 32 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.
- ארבע מושבות משמשים כדי להפוך 5 מ"לתרבויות לילה LB עם 12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol. אלה משמשים המושבה PCR לעיל כדי לאשר את הקלטת הוכנסה. אנו משתמשים הן את ה-GFP קצר / TAP oligos ספציפיים oligos איגוף כדי להדגים את הזכות להכניס לאתר הנכון. ה-GFP הוא ~ 800 נ"ב ו TAP הוא ~ 550 נ"ב לעומת galK הוא 1.4 kb.
- הכינו מלאי גליצרול.
V. תוספת של ג'ין UNC-119 על ידי רקומבינציה cre-loxP
האמצעים הנפוצים של יצירת חיות טרנסגניות עם fosmids שונה היא באמצעות הפגזה biolistic. טכניקה זו משתמשת ב-DNA מצופה חלקיקי זהב להכניס לתוך ה-DNA fosmid ג elegans. בעלי חיים מהונדס מזוהים בדרך כלל דרך ההצלה של מוטציה UNC-119 עם transgene UNC-119. בשלב זה, הגן-119 UNC מתווסף עמוד השדרה fosmid בחבר העמים על ידי רקומבינציה cre-loxP עם pLoxP UNC-119 פלסמיד (איור 2C).
- הכן המוסמכת SW106 חיידקים שנשאו את fosmid שונה מהצעד 4.9 באמצעות צעדים 2.5-2.9. לא האם להשרות על 42 ° C.
- Electroporate עם 50 ננוגרם. pLoxP UNC-119 מבית מיני הכנה באמצעות הפער cuvettes 0.1 ס"מ electroporator Eppendorf 2510 נקבע על 1350 וולט.
- שחזור חיידקים LB המכיל arabinose 0.1% במשך שעה 1 ב 32 ° C.
- פלייט aliquots על צלחות LB המכיל אמפיצילין 50μg/mL ו 12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol. לדגור על 32 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אשר בוחר לשילוב של pLoxP UNC-119 לתוך fosmid.
- לגדול תרבות לילה LB המכיל אמפיצילין 50μg/mL ו 12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol. השתמש 0.5 עבור μL PCR לוודא את נוכחותו של הגן UNC-119 עם UNC-119 F (5'-CAAATCCGTGACCTCGACAC-3 ") ו UNC-119 R (5'-CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG-3") oligos (טבלה 1).
- הפוך המניות של גליצרול fosmid הסופי.
VI. בקנה מידה גדול Fosmid הכנה
כדי להקל על קבלת כמויות גדולות יותר של ה-DNA fosmid הדרושים הפגזה, בשלב זה fosmid מועברת EPI300 חיידקים. זן זה יש את היכולת להגדיל את מספר עותק fosmid להגדיל את התשואות במהלך הכנת ה-DNA.
- לגדול תרבות הלילה 5 מ"ל של חיידקים מן הצעד 5.5 ב LB המכיל אמפיצילין ו chloramphenicol על 32 ° C. השתמש Epicentre fosmid ערכת הכנה כדי לבודד את fosmid מ 1.5 מ"ל של התרבות.
- Electroporate ~ 50 ng לתוך EPI300 חיידקים באמצעות הפער cuvettes 0.1 ס"מ להגדיר Eppendorf 2510 electroporator ב 1350 וולט. EPI300 החיידקים ניתן לרכוש ביוטכנולוגיות Epicentre (מדיסון, ויסקונסין).
- שחזור חיידקים LB שעה 1 ב 37 ° C. פלייט aliquots על אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ו - 12.5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol.
- לגדול לגרום EPI300 חיידקים המכילים את fosmid שונה באמצעות ההוראות הכלולות. תרבות 50 מ"ל המושרה ייתן> 10 מיקרוגרם של ה-DNA fosmid מטוהרים. לטהר את fosmid עם fosmid Epicentre ערכת הכנה.
VII. הפצצה
- השתמש 10 מיקרוגרם. דנ"א fosmid להפציץ את המתח DP38 תולעת כמתואר (ד הוכבאום, א פרגוסון, וא 'פישר, יופיטר, in press).
VIII. נציג תוצאות
שינוי של fosmids דרך recombineering חזקים אחוזי הצלחה של 90%> בשלב סלקציה שלילית הם נצפו באופן קבוע 2. פרוטוקול זה גם לוקח ~ 2 שבועות כדי להשלים את מה שהופך את הכנת transgenes מהיר למדי. הפרוטוקול הוכח גם על ידי מעבדות אחרות ניסו ללא הצלחה 20.
| אוליגו | רצף |
| C לטווח TAP F | ATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG |
| C לטווח TAP R | GGTTGACTTCCCCGC |
| F הדגל GFP | ATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG |
| הדגל-R-GFP | CAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG |
| N לטווח TAP F | ATGGCAGGCCTTGCGC |
| N לטווח TAP R | AAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT |
| galK F | CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA |
| galK R | TCAGCACTGTCCTGCTCCT |
| UNC-F 119 | CAAATCCGTGACCTCGACAC |
| UNC-119 R | CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG |
טבלה 1. Oligonucleotides המשמש PCR.
| פלסמידים | מקור | ניתן להשיג |
| Fosmid שיבוט | Geneservice בע"מ | Geneservice |
| pGalK | 15 | NCI-פרדריק |
| pMOD4-RT-G | 2 | Addgene |
| pMOD4-galK-G | ||
| pMOD4-galK-GT | ||
| pLoxP-UNC-119 | ||
| pMOD4-GFP | ||
| בקטריה | ||
| SW106 | 15 | NCI-פרדריק |
| EPI300 | Epicentre ביוטכנולוגיות | Epicentre |
| EC100D פיר-116 | ||
טבלה 2. הזנים וזמינות וקטור.
באיור 1.
תרשים של pMOD4-galK-G ו-pMOD4 galK-GT, pMOD4 GFP, pLoxP-UNC-119
PMOD4-galk-G הפלסמיד כולל הקלטת galK (שחור) מוקף 50 אזורים נוקליאוטידים זהים 5 'ו 3' מסתיים של הדגל (בראון)-GFP (ירוק) בעוד pMOD 4-galK-GT מורכב galK קלטת מוקף הן את הדגל GFP האזורים הומולוגיה ו -50 אזורים נוקליאוטידים זהים 5 'ו 3' הקצוות של N-מסוף בטרמינל C-TAP (כחול וכתום, בהתאמה). pMOD4-GFP הדגל מורכב הקלטת GFP מלא עם תג דגל '5 ו pLoxP UNC-119 מכיל את הרצף הגנומי-UNC 119 (סגול) בתוך פלסמיד המכיל באתר loxP. פלסמידים כל לנצל את R6K מבוססי pMOD4 (אדום) עמוד השדרה, אשר אינו מסוגל לשכפל SW106.
איור 2.
סקירה כללית של תהליך recombineering galK
איור 2A-2C דמויות נפרדת המציגה את הצעדים ואת הזמן הכרוכים recombineering באמצעות קלטת galK. אלו הן דמויות באותו ימוזגו באיור 2d, אך ניתנת בנפרד עבור בהירות להקל על הקריאה. Fosmid ריבית משתנה הראשון בהליך בן שני שלבים הכוללים החדרת הקלטת galK מוקף 50 אזורים bp של הומולוגיה אל הדגל GFP או TAP (איור 2 א) ואחריו החלפת קלטת זו על ידי ה-GFP דגל או TAP ( איור 2B). לאחר מכן סמן UNC-119 לשימוש להפקת חיות טרנסגניות מוכנס לתוך האתר LoxP על עמוד השדרה fosmid (איור 2C).
איור 2 ד מראה דמות הממוזגת של ההליך recombineering galK.
תמציתי של הליך recombineering galK כמתואר לעיל כולל הזמן הנדרש לכל שלב מן מיזוג איור 2A-2C.
איור 2 א. הכניסה galk ב recombineering galk.
איור 2b. (GFP / TAP) TAG הכניסה recombineering galk.
איור 2c. התוספת של UNC-119.
איור 2. הסקירה הממוזגת של recombineering galk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדור של transgenes מ fosmids מציעה את היתרון של שמירה על כל מרכיבי מקדם הילידים, וריאנטים אחוי, ו 3 'UTR אלמנטים רגולטוריים. זה יכול להוביל להקמת transgene שהוא מהורהר יותר של דפוס הביטוי הילידים, או בנייה של transgene פונקציונלי כאשר גישות אחרות להיכשל 5. Transgenes וכתוצאה מכך יכול לשאת מגוון של תגים epitope כולל GFP או תג TAP.
בניית transgenes מעורבים שלושה שלבים אשר מבוצעים הכל ב SW106 15 כתם חיידקי. ראשית, הגן galK משתלבת האתר הרצוי fosmid להיות שונה דרך recombineering galK עם מוצר ה-PCR נושאת מוקף נשק הומולוגיה משלים fosmid היעד. שיפור שפיתחנו הוא שילוב של אזורים הומולוגיה עבור GFP דגל או תג לנצל את הקלטת galK המאפשר בקבוצה אחת של oligos לשמש את השלבים הראשון והשני של שינוי fosmid והורדת עלות oligos. פישוט נוסף הוא השימוש וקטור R6K מבוססות, אשר אינו מסוגל לשכפל SW106 זן חיידקים מבטלת את הצורך לעכל את וקטור האב. שנית, הקלטת galK מוחלף תגיות כגון TAP או GFP אשר התמזגו אז עם הגן של הריבית על fosmid. שלב זה הוא חזק מאוד fosmids שונה בצורה נכונה רבים מתקבלים באופן שגרתי. לבסוף, הסמן-119 לבחירה UNC עבור הדור של תולעים מהונדס מתווסף fosmid. זה יוצר סמן CIS ו מקושר ישירות אל fosmid שונה. סמן-119 UNC לבחירה הוא נרחב תואם microinjection והן הפגזה biolistic 17,21. הפצצה זו שימושית במיוחד כאשר מספר משמעותי של קווי מהונדס יכול להיות שנוצר על ידי משפט בודד ואף אדם לא מנוסה יכול ליצור חיות טרנסגניות.
היבט מרכזי של פרוטוקול זה הוא השימוש באמבט מים רועד חממה ההלם צעדים חום במהלך תקופת ההכנה של SW106 תאים המוסמכות. מצאנו כי השימוש באינקובטור האוויר לא הצליח לחמם את תרבית החיידקים עד 42 מעלות צלזיוס גם לאחר 30 דקות של שייקר (לא מוצג). ניסינו גם את החיידקים טבילה באמבט מים עם תוצאות לא טובים (לא מוצג). אמבט מים רועד ניתן לרכוש בשימוש ממספר חברות אם לא כבר זמין במעבדה.
מעבר הכניסה של תגי ה-GFP או epitope, התחלנו גם להשתמש בטכניקה זו mutagenesis אתר ספציפי של גנים תולעת נישא על fosmids (א פרגוסון וא פישר, לא פורסם). דבר זה הושג באמצעות שימוש אוליגו חד גדילי המכיל את השינוי מוקף 50 נ"ב במורד הזרם של האתר כדי להחליף את הגן galK. השילוב של mutagenesis fosmid יחד עם שימוש של מוטציה בגן נוקאאוט יכול לאפשר תפקוד vivo של isoforms גן, בתחומים מסוימים, או חומצות אמינו ספציפיות שייקבעו. בהמשך הפרוטוקול שלנו מסיר את הסמן galK בסוף כך שניתן לבצע סיבובים נוספים של שינוי כדי להוסיף תגיות epitope נוסף או לבצע mutagenesis על לבנות מתויג.
לבסוף, סביר להניח כי חלק ריאגנטים אלה יכולים לשמש בבניית BACS או fosmids שונה על ידי מעבדות לא באמצעות תולעים. PMOD4 galK-G ו-GT pMOD4 galK גנים עדיין שומרים את הגן galK כל כך oligos שפורסמו בעבר עדיין ניתן להשתמש כדי להגביר את הגן galK 15. זה עדיין שומרים את היתרונות של השימוש מקור שכפול R6K ביחס לא צורך לעכל את ההורה או פלסמיד בזהירות לטהר את מוצר ה-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לינדסי נאש לקבלת עזרה בפיתוח הטכניקה. עבודה זו מומנה על ידי NIH כדי להעניק AG028977 אלף, פיילוט מענק מאוניברסיטת פיטסבורג OAIC (AG024827), וקרנות זרע מאוניברסיטת פיטסבורג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FosmidMAX kit | Epicentre Biotechnologies | FMAX046 | |
| GoTaq | Promega Corp. | M7122 | |
| MOPS Media | TEKnova, Inc. | M2120 | |
| 0.132 M Potassium phosphate solution | TEKnova, Inc. | M2102 | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| 2-deoxygalactose | Sigma-Aldrich | D4407 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | F-530S | |
| MacConkey agar base | BD Biosciences | 281810 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3131 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 |
References
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
- Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
- Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
- Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
- Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
- Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
- Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
- Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
- Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
- Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
- Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
