Summary
게놈과 phenotypic 유사 콘텐츠의 집합 내에서 게놈 변화의 영양소 스트레스 결과에 따라 일부 아마 품종을 재배. 특정 사이트에서 복잡한 삽입 다양한 영양 정권 아래에서 성장과이 사이트 주변의 유전자 표현의 변화와 연결되어 있습니다.
Abstract
어떤 아마 품종들은 게놈을 수정하고 이러한 수정이 여러 세대에 걸쳐 상속 수에 의해 영양 스트레스에 대응. 또한 이러한 게놈 변화와 관련된 것은 phenotypic 유사 1,2을 물려 전할 수있는 있습니다. 세 가지 다른 영양 조건 하에서 재배 아마 다양한 스토 몬트 서러스 (PL)는 중 (제어 조건 하에서) inducible 유지 또는 안정 각각 높거나 낮은 영양 조건 하에서 성장하여 규모 genotroph을 하나에 수정이 될 수 있습니다. 이러한 조건의 각에서 초기 성장으로 인한 라인이 이후 세대에서 동일한 조건 하에서 재배하면 더 나은 성장을 표시, 특히 아베 라인은 높고 낮은 영양소 모두 아래에서 성장하는 식물 미만 나타내는 컨트롤 치료하에 최고의 성장 스트레스. 식물 영양 스트레스 증가하는 동안 물려 전할 수있는 변화의 유도와 관련된 게놈 변화 중 하나는 삽입 요소의 모양 (LIS - 1) 3, 4이다. 이 삽입 행사와 관련, 아마 다양한 스토 몬트 서러스 (PL)이 세 가지 영양 조건 하에서 재배 때하는 것이 중 (제어 조건 하에서) 변함없다 수 삽입은 모든 식물에 나타납니다 (낮은 영양소 이하) 이것이 전염이있다 다음 세대하거나 삽입 (또는 일부)가 나타나지만 세대 (높은 영양소 이하) 4 전송되지 않습니다. 이 삽입의 모양의 주파수는 또한 후속 세대의 성장 반응과 일치 긍정적인 선택, 아래에 나타냅니다. 성장의 다양한 단계에서 수확 잎 또는 meristems는 DNA와 RNA 분리에 사용됩니다. RNA는 다양한 성장 환경 및 / 또는 t 그는 존재 / LIS - 1의 부재와 관련된 표현의 변화를 식별하는 데 사용됩니다. 분리된 DNA는 삽입가 발생하는 그 식물을 식별하는 데 사용됩니다.
Protocol
1. 유도 조건에서 아마의 성장.
- 5 "냄비는 흙으로 가득하고 firmed 있습니다.
- 냄비 당 세 씨를 ¼ 인치 깊이 심어져 있고 토양은 씨앗을 통해 firmed 있습니다.
- 냄비는 다음 적절한 영양 솔루션 100ml로 물결 무늬가있는 아르
- 비 유도 제어 (C) 조건 매주 1 / 10 일 강도 촉진제를 사용합니다. 높은 영양 상태 (NPK 치료) 전체 강도의 기적을했다하면 매주 적용 자랍니다. 낮은 영양 - 식물은 성장에 걸쳐 적용되는 수돗물을했다. (듀런트 1971, 컬리스 1980).
- 식물은 여름에 자연광 아래에서 재배하고 있습니다. 겨울 동안 그들은 16 / 8시간 진한 / 라이트 사이클과 나트륨 불빛 아래에서 재배하고 있습니다.
- 주간 간격으로 출발하고 meristems는 회수됩니다.
- 식물은 빠른 액체 질소에 냉동 수 있습니다.
검색 결과
세 genotypes의 조건 (그림 1)에 따라 서로 다른 상대 속도로 성장합니다. 따라서 제어 조건 하에서 경기수 라인 L은 S (그림 1A)보다 더 활발한되는 최고 자랍니다. 낮은 영양분 아래 (물), S는 L 또는 경기수 (그림 1B) 하나보다 커집니다. 높은 영양에서 (NPK) L은 S (그림 1C)보다 약간 더 나은 성장 경기수보다 커집니다. 세 가지 서로 다른 트리 트먼트에 따라 재배 라인의 각 사이의 비교는 그림 1 D에 표시됩니다 - F. PL은 통제 조건 (그림 1D)에 따라 가장 높은 성장 영양 (그림 1E)와 S L 이하 최고 마찬가지로 높은 영양 및 제어 조건을 모두 아래 (그림 1 층).
이러한 데이터는 세 줄의가 세 가지 환경에 따라 자신의 성장에 따라 차별화된 수 보여줍니다. 음표의 L은 NPK 조건 (그것이 유발되었던 이하)에서 최고의 성장하는 동안 아베가 제어 조건 하에서 최선을 성장한다는 것입니다. S는 향상된 영양 조건을 활용할 수있는 것이 아니라 매우 낮은 영양 조건 하에서 성장하는 것이 좋습니다 수있다 세 조건에서 동일한 대해 자랍니다.
식물의 분화와 관련된 성장 매개 변수는 식물 높이 (그리고 각 잎 사이의 거리는이 internode 길이,와 관련된), 잎 크기 및 분기의 정도를 포함합니다. 경기수에 대한 제어 조건 하에서 식물은 가지와 높이이고 잎이 크고 진한 녹색입니다. 낮은 영양소에서 식물은 매우 짧은, 각 잎 사이의 거리도 매우 짧은되고 단풍이 작고 밝은 녹색입니다. 끝에 나뭇잎이 줄기 내려보다 어두운 녹색입니다. 높은 영양소 아래 공장은 제어 조건의 주요 줄기 및 측면 촬영 모두 제어 식물보다 짧은 것을 제외하고는 매우 유사하게 나타납니다. 대형 genotroph에 대한 식물은 높은 영양분 아래에서 가장 활발한 성장을 제외하고는 아베의 것과 매우 유사. 다시 낮은 영양소 아래에있는 식물은 매우 짧은이며 밝은 녹색 잎이있다. 나뭇잎이 낮은 영양소에 따라 밝은 녹색 있지만 S genotroph는 세 가지 환경에서 마찬가지로 자랍니다. 그러나, 낮은 영양 상태에서 S genotroph은 아베 또는 L 라인 중 하나를보다 더 활발한입니다.
2. 플렉스 meristems과 나뭇잎의 RNA와 DNA extractions은 별도로 수행됩니다. 로체 총 RNA 준비 키트는 RNA extractions과 Qiagen DNeasy 식물 DNA 준비 키트는 DNA extractions 사용되었다 위해 사용되었다.
RNA 추출
- 3 meristems 플러스 일부 주변 단풍은 eppendorf 튜브에 저장 cryovial에서 이동 및 접지 준비 때까지 액체 질소에 게재됩니다.
- 무균 모래는 튜브에 추가되고 조직은 고급까지 micropestle를 사용하여 접지합니다.
- 로체 총 RNA 준비 Kit에서 400 UL 용해 / 바인딩 버퍼가 추가되며 대단히 짧은 시간이 표시되지 않을 때까지 조직 추가지면입니다.
- 샘플은 15 초 모래 및 이물질을 수집하는 13,000 RPM에서 1 분 늘인 다음 용해를 지원하고 vortexed입니다.
- 뜨는은 열을 회전에 추가되고 감독으로 RNA 준비 키트 지침의 나머지 부분은 다음입니다.
DNAse 치료
- 10X DNAse 버퍼의 10분의 1 RNA 샘플 볼륨이 추가됩니다.
- DNAse 30 단위가 추가되고 반응은 37 incubated 있습니다 ° 30 분 및 70 ° C 5 분위한 C.
역방향 전사
- cDNA 키트에 적용 Biosystems RNA는 당 방향, 37 incubated 반응 ° C 1 시간 95 ° C 5 분.로 사용됩니다
cDNA는 다음 PCR이나 qPCR에 사용됩니다
qPCR
qPCR는 ABI의 1 단계 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 모든 assays는 각 실행 세중의에서 수행되었다. 굴지의 유전자는 사본 번호를 컨트롤처럼 사용되었다가장 가능한 하우스 키핑 유전자.
- 적절한 프라이머 쌍은 1μl의 각 튜브에 추가되었습니다.
- cDNA는 적절한 농도와 9μl로 희석되었다 각각의 튜브에 추가
- 2X 전원 SYBR 녹색 PCR MasterMix (ABI)의 10μl와 각 튜브에 추가되었습니다
- 프로그램 증폭 프로그램은 보낸 사람 :
- 95 10 분 ° C
- 95에서 15sec 40 사이클 ° C, 60 ° C에서 1 분
증폭 특이성을 확인하기 위해 열 변성 단계 - 상대 표현 수준 2의 값이 (- CTactin CTunknown)에 의해 결정됩니다.
DNA 준비
- Qiagen DNeasy 식물 DNA 준비 Kit에서 버퍼 AP1은 microfuge 튜브의 살균 모래, 6 단풍에 추가됩니다. 아무 대단히 짧은 시간이 표시되지 않습니다 때까지 조직은 micropestle과 땅입니다.
- 키트 지침은 지시대로 따라합니다.
검색 결과
줄기 따라 다양한 위치에 나뭇잎에서 분리된 DNA의 PCR 증폭은 식물 유도 조건 (4)에 따라 성장하는 동안 LIS - 1의 모습이 발생하는 것을 보여줍니다. qPCR 결과 LIS - 1 (또는 유도와 관련된 다른 게놈 변경)의 존재가 LIS - 1의 바로 근처 (그림 2)에서 유전자의 표현에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 그림 2에 표시된 여섯 유전자는 모든 differentially 넷은 높은 PL 표현 (LIS - 1 제외) S의 높은 표현을 (LIS - 1를 가지고있는)하는 데 두 필요로 아베와 S로 표현됩니다. 패널 1과 2는 LIS - 1의 삽입 지점에 가장 가까운 두 유전자입니다. 서로 다른 성장 조건 하에서 큰 genotroph (유발 변화를 가지고 있지만 LIS - 1을하지 않는)와 표현에서 이러한 유전자의 표현은 LIS - 1과 표현의 변화 사이에 인과 관계를 결정하기 위해 필요한 것입니다.
그림 1. 경기수, L과 S는 세 가지 다른 영양소 정권 아래에서 성장. 패널 - 제어, B - 낮은 영양소 및 C - NPK. D - 경기수, 전자 - S, F - 제가 패널 D를 - F 왼쪽에서 오른쪽으로 : 낮은 영양분, 제어 및 NPK. D - 경기수, 전자 - L, F - S.
LIS - 1의 삽입 지점 주위에 그림 2. 유전자 발현. 진 1 (성장 억제제) LIs1 즉시 5 '이며 LIS - 1의 유전자 2 (킵 관련 cyclin 의존 키나제 억제제 아이디 3 ". 다른 유전자는 모든에서 만들어진 같은 비계 (~ 5백킬로바이트) 갈래 전체 플렉스 게놈 시퀀스하시기 바랍니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 낮은 영양 조건 하에서 재배 스토 몬트 서러스의 식물의 각각의 나뭇잎에서 추출한 DNAs의 PCR의 amplifications. PCR 제품은 2 % 아가로 오스 - TBE 젤에서 분리되었다. uninserted 사이트 패널에 표시됩니다, 삽입된 사이트의 두 끝을는 패널 B와 C로 표시됩니다 리프 샘플 1-6은 예제 1 파종 후 초기되는 주간 간격으로 고립되었다.
Discussion
플렉스는 본질적으로 불안 정한 게놈을 가지고 나타납니다. 몇 세대에 걸쳐 재배 때 상업 섬유 아마 종류의 숫자가 급격히 비 균일됩니다. 같은 관찰은 오일 플렉스 종류에 대한 진정한 보유하지 않습니다. 따라서 섬유의 품질과 게놈 불안정성에 대한 선택 사이의 연관이있을 나타납니다. 환경 원래 섬유 작물의 성장의 농경 관찰 조사를 통해 확인되었습니다 아마 변화를 물려 전할 수있는 유도. 특정 phenotypic과 게놈 유사 이러한 반복 관측 환경 스트레스가 발생할 수 있습니다 게놈 rearrangements의 제품군에 영향을 미칠 수있는 방법의 질문을시킵니다. 특정 환경에 대응하기 LIS - 1의 반복 모습이 돌연변이 직접 또는 간접적으로 선택되는과 일치합니다. 다양한 치료에 의해 유도 라인의 성장은 또한 관련 유도하는 조건 하에서 향상된 성능을 나타냅니다. 또 다시 LIS - 1의 존재와 관련된 표현의 변경 사항이이 삽입 식물 성능에 영향을 미칠 것을 나타냅니다. 비디오 프레 젠 테이션은 기존의 인쇄물을 통해 전달하는 것은 불가능 방식으로 공장 phenotypic 변화를 관찰을위한 포럼을 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
