Summary
Groeiende aantal vlas variëteiten onder voedingsstoffen stress resulteert in genomische variatie binnen een subset van het genoom en fenotypische variatie. Een complex plaatsing op een bepaalde locatie wordt geassocieerd met de groei onder verschillende voedingsstoffen regimes en met veranderingen in genexpressie rond deze site.
Abstract
Sommige soorten vlas te reageren op voedingsstoffen stress door aanpassing van hun genoom en deze aanpassingen kunnen worden overgenomen door vele generaties. Ook in verband gebracht met deze genomische veranderingen erfelijk fenotypische variaties 1,2. Het vlas variëteit Stormont Cirrus (Pl), de teelt onder drie verschillende voedingsstoffen omstandigheden kan blijven induceerbaar (onder de controle voorwaarden), of wordt stabiel aangepast om de grote of kleine genotroph door de groei bij hoge of lage voedingsstoffen voorwaarden respectievelijk niet. De lijnen die voortvloeit uit de initiële groei in elk van deze voorwaarden lijken beter te groeien wanneer ze groeien onder dezelfde voorwaarden in de volgende generaties, met name de Pl lijn groeit het beste onder de controle behandeling te geven dat de planten groeien onder zowel de hoge als lage voedingsstoffen zijn onder stress. Een van de genomische veranderingen die worden geassocieerd met de inductie van erfelijke veranderingen is het verschijnen van een insertie element (LIS-1) 3, 4, terwijl de planten groeien onder de voedingsstoffen stress. Met betrekking tot deze plaatsing evenement, het vlas variëteit Stormont Cirrus (Pl), de teelt onder drie verschillende voedingsstoffen omstandigheden kan blijven ongewijzigd (onder de controle condities), hebben de toevoeging verschijnen in alle planten (onder lage voedingsstoffen) en hebben dit doorgegeven aan de volgende generatie, of het inbrengen (of delen ervan) verschijnen, maar niet worden overgedragen van generatie op generatie (onder hoge voedingsstoffen) 4. De frequentie van het verschijnen van deze toevoeging geeft aan dat het onder positieve selectie, die ook in overeenstemming is met de groei van respons in de volgende generaties. Bladeren of meristemen geoogst in verschillende stadia van de groei worden gebruikt voor DNA-en RNA-isolatie. Het RNA wordt gebruikt om de variatie te identificeren in de expressie geassocieerd met de verschillende groei-omgevingen en / of t hij de aanwezigheid / afwezigheid van LIS-1. De geïsoleerde DNA wordt gebruikt om die installaties waarin de invoeging zich heeft voorgedaan te identificeren.
Protocol
1. Groei van het vlas onder inducerende omstandigheden.
- 5 "potten zijn gevuld met grond en verstevigd.
- Drie zaden per pot worden geplant ¼ inch diep en de bodem verstevigd over de zaden.
- De potten worden vervolgens besproeid met 100 ml van de juiste voedingsstoffen oplossingen
- De niet-inducerende control (C) voorwaarden gebruik maken van een 1 / 10 e kracht van Miracle-Gro elke week. De hoge voedingsstoffen aandoening (NPK behandeling) had volle kracht Miracle Grow toegepast per week. Lage voedingsstof - planten alleen had leidingwater toegepast tijdens hun groei. (Durrant 1971, Cullis 1980).
- De planten worden geteeld onder natuurlijk licht in de zomer. Tijdens de winter zijn ze geteeld onder natrium lampen met een 16 / 8 uur licht / donker-cyclus.
- Met wekelijkse intervallen bladeren en meristemen worden verzameld.
- Het plantmateriaal is snel ingevroren in vloeibare stikstof.
Resultaten
De drie genotypen groeien met verschillende relatieve tarieven afhankelijk van de omstandigheden (figuur 1). Daarom onder controle van de voorwaarden Pl lijn groeit het beste met L zijn krachtiger dan S (figuur 1a). Onder lage voedingsstoffen (water), S groeit beter dan zowel L of Pl (Figuur 1b). Onder hoge voedingsstoffen (NPK) L groeit beter dan Pl die alleen groeit iets beter dan S (figuur 1c). Een vergelijking tussen elk van de lijnen gekweekt onder de drie verschillende behandelingen is weergegeven in figuur 1 d - f. Pl groeit het beste onder controle omstandigheden (figuur 1d), L de beste onder hoge voedingsstof (Figuur 1e) en S eveneens onder zowel hoge concentraties nutriënten en controle omstandigheden (figuur 1f).
Deze gegevens tonen aan dat de drie lijnen kunnen worden gedifferentieerd op basis van hun groei onder de drie omgevingen. Van de nota is dat de Pl best groeit onder de controle condities, terwijl L groeit het beste onder de NPK omstandigheden (waaronder het werd geïnduceerd). S groeit ongeveer hetzelfde in alle drie de voorwaarden, dat wil zeggen, het is niet in staat om te profiteren van de verbeterde voedingsstoffen voorwaarden, maar is beter in staat om te groeien onder zeer lage voedingsstoffen omstandigheden.
De groei parameters die relevant zijn voor de differentiatie van de planten zijn de hoogte van de plant (en in verband met deze internodium de lengte is, dat de afstand tussen elk blad), het blad grootte en de mate van vertakking. Voor de Pl onder controle omstandigheden de plant is lang met takken en de bladeren zijn groot en donker groen. Onder lage voedingsstoffen van de plant is erg kort, de afstand tussen elk blad is ook erg kort en de bladeren zijn klein en licht groen. De bladeren aan het uiteinde donkerder groen dan die lager op de stengel. Onder hoge voedingsstoffen de plant lijkt veel op dat de omstandigheden onder controle, behalve dat zowel de belangrijkste stam en de zijscheuten korter zijn dan in de controle planten. Voor de grote genotroph de planten erg lijken op die van de Pl, behalve dat de meest krachtige groei van de onder hoge voedingsstoffen. Weer onder een laag voor de plant is erg kort en heeft lichtgroene bladeren. De S genotroph groeit eveneens in alle drie de omgevingen, hoewel de bladeren zijn lichter groen onder het lage voedingsstoffen. Echter, in de lage voedingsstoffen voorwaarden de S genotroph is veel krachtiger dan een van de Pl-of L-lijnen.
2. RNA en DNA extracties uit vlas meristemen en bladeren worden afzonderlijk gedaan. De Roche totale RNA prep-kit werd gebruikt voor de RNA-extracties en de Qiagen DNeasy Plant DNA-prep-kit werd gebruikt voor de DNA-extracties.
RNA-extractie
- 3 meristemen plus een aantal omliggende bladeren zijn verplaatst van de opslag cryovial in eppendorfbuisje en geplaatst in vloeibare stikstof tot klaar om te worden gemalen.
- Steriel zand wordt toegevoegd aan buis en weefsel is de grond met behulp van een micropestle tot boete.
- 400 ul lysis / bindingsbuffer van Roche in totaal RNA prep kit is toegevoegd en weefsel is verder de grond totdat er geen klontjes zichtbaar zijn.
- Monster wordt vortex gedurende 15 seconden om vervolgens lysis hulp en gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij 13.000 rpm om zand en vuil te verzamelen.
- Supernatant wordt toegevoegd aan kolom draaien en de rest van de RNA-prep-kit instructies worden gevolgd zoals aangegeven.
DNAse behandeling
- 1 / 10 RNA monstervolume van 10X DNAse buffer wordt toegevoegd.
- 30 eenheden van DNAse wordt toegevoegd en de reactie wordt geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 min en 70 ° C gedurende 5 minuten.
Reverse transcriptie
- Applied Biosystems RNA naar cDNA kit wordt gebruikt als per richtingen reactie geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 uur en 95 ° C gedurende 5 minuten.
Het cDNA wordt vervolgens gebruikt in PCR of voor qPCR
qPCR
qPCR werd uitgevoerd met behulp van een ABI Stap een systeem. Alle testen werden uitgevoerd in drievoud op elke run. De actine-gen werd gebruikt als een kopie-aantal controlede beste beschikbare housekeeping gen.
- De juiste primer paar werd toegevoegd aan elke buis in 1μl.
- Het cDNA werd verdund tot de juiste concentratie en 9μl toegevoegd aan elke buis
- 10μl van de 2x Macht SYBR Green PCR mastermix (ABI) en werd toegevoegd aan elke buis
- Het programma versterking programma is:
- 10 minuten bij 95 ° C
- 40 cycli van 15 seconden bij 95 ° C, 1 min bij 60 ° C
Thermische denaturatie stap naar versterking specificiteit te controleren - De relatieve expressie niveaus werden bepaald door de waarde van 2 (CTunknown - CTactin).
DNA-voorbereiding
- Buffer AP1 van Qiagen DNeasy Plant DNA-prep-kit is toegevoegd aan 6 blaadjes met steriele zand in een microfugebuis. Het weefsel is grond met micropestle totdat er geen klontjes zichtbaar zijn.
- De kit instructies worden gevolgd zoals aangegeven.
Resultaten
PCR-amplificatie van het DNA geïsoleerd van bladeren op verschillende posities langs de stengel toont aan dat de verschijning van LIS-1 gebeurt, terwijl de planten groeien onder inducerende omstandigheden (4). De qPCR resultaten tonen aan dat de aanwezigheid van LIS-1 (of een andere genomische veranderingen geassocieerd met de inductie) de expressie van genen beïnvloedt in de directe omgeving van de LIS-1 (Figuur 2). De zes genen weergegeven in figuur 2 zijn alle differentieel tot expressie in de Pl-en S met vier met een hogere expressie in PL (zonder LIS-1) en twee met hogere expressie in S (die wel LIS-1). Paneel 1 en 2 zijn de twee genen die het dichtst bij het invoegpunt van LIS-1. De expressie van deze genen is in de grote genotroph (dat heeft geleid tot wijzigingen, maar heeft geen LIS-1) en de expressie onder verschillende groeiomstandigheden nodig zal zijn om een oorzakelijk verband tussen LIS-1 en de expressie veranderingen vast te stellen.
Figuur 1. Pl, L en S geteeld onder drie verschillende voedingsstoffen regimes. Panelen een - controle, b - een lage voedingsstoffen en c - NPK. d - Pl, e - S, f - L. Panelen d - f van links naar rechts: laag voedingsstoffen, controle en NPK. D - Pl, e - L, F - S.
Figuur 2. Genexpressie rond het punt van insertie van LIS-1. Gen 1 (Inhibitor van de groei) is onmiddellijk 5 'naar LIs1 en het gen 2 (Kip-gerelateerde cycline-afhankelijke kinase-inhibitor id 3 "van LIS-1. De andere genen zijn allemaal langs dezelfde steiger (~ 500kb) opgebouwd uit de volledige vlas genoomsequentie. alstublieft Klik hier om een grotere afbeelding te zien .
Figuur 3. PCR amplificaties van DNA's uit individuele bladeren van planten van Stormont Cirrus gegroeid onder lage voedingsstoffen omstandigheden. De PCR-producten werden gescheiden op een 2% agarose-TBE gel. De uninserted site is weergegeven in een panel, zijn de twee uiteinden van de ingevoegde plaats die op Panels b en c. Bladmonsters 1-6 werden geïsoleerd met wekelijkse intervallen met het monster 1 de vroegste na het zaaien.
Discussion
Vlas lijkt te hebben een inherent instabiel genoom. Een aantal commerciële vezelvlas soorten in korte tijd uitgegroeid niet-uniforme wanneer gekweekt voor een paar generaties. Dezelfde observaties lijken niet te gelden voor de olie vlas rassen. Daarom lijkt er een verband tussen de selectie voor vezels kwaliteit en genoom instabiliteit. De milieuvriendelijke geïnduceerde erfelijke veranderingen in de sector vezelvlas werden oorspronkelijk geïdentificeerd door middel van het onderzoek van de agronomische opmerkingen van de groei van de vezel gewas. Deze herhaalbare waarnemingen van de specifieke fenotypische en genomische veranderingen roept de vraag op hoe de milieu-stress kan de suite van de genomische herschikkingen die zich kunnen voordoen beïnvloeden. De herhaalde verschijning van LIS-1 in reactie op bepaalde omgevingen is in overeenstemming met deze mutatie wordt direct of indirect gekozen. De groei van de lijnen veroorzaakt door verschillende behandelingen geeft ook aan een verbeterde prestatie onder de relevante inducerende omstandigheden. De veranderingen in expressie ook in verband gebracht met de aanwezigheid van LIS-1 weer geeft aan dat deze toevoeging van invloed zijn plant performance. De video presentatie biedt een forum voor het observeren van de plant fenotypische veranderingen op een manier die onmogelijk over te brengen via de traditionele drukwerk.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
