المستحثة بيئيا توريثه التغييرات في كتان

Summary

تزايد بعض اصناف الكتان تحت الضغط النتائج المغذيات في الاختلاف الجيني في داخل مجموعة فرعية من الجينوم والتباين المظهري. ويرتبط المجمع الإدراج في موقع معين مع النمو في ظل الأنظمة المختلفة والمواد الغذائية مع التغيرات في التعبير الجيني للتغلب على هذه المواقع.

Abstract

بعض أصناف الكتان الاستجابة للإجهاد المواد الغذائية عن طريق تعديل الجينوم ، ويمكن أن تكون ورثت هذه التعديلات من خلال أجيال عديدة. يرتبط أيضا مع هذه التغيرات الجرثومية وراثية الاختلافات المظهرية ^1،2. لا يمكن للمجموعة الكتان ستورمونت سيروس (PL) عندما نمت في ظل الشروط الثلاثة مغذيات مختلفة ، إما محرض (تحت ظروف التحكم) ، أو أن تصبح تعديل ستابلي إما إلى genotroph كبيرة أو صغيرة من النمو في ظل ظروف غذائية عالية أو منخفضة على التوالي. خطوط الناتجة عن النمو الأولي تحت كل هذه الظروف يبدو أن تنمو على نحو أفضل عندما نمت في ظل نفس الظروف في الأجيال اللاحقة ، ولا سيما خط رر ينمو بشكل أفضل تحت العلاج السيطرة مشيرا الى ان النباتات التي تنمو تحت المواد الغذائية على حد سواء العالية والمنخفضة وتحت الإجهاد. واحدة من التغيرات الجرثومية التي ترتبط مع تحريض الموروثة التغييرات هو مظهر عنصر الإدراج (LIS - 1) ^{3 ، 4} في حين أن النباتات تنمو تحت وطأة المغذيات. فيما يتعلق بهذا الحدث الإدراج ، وتنوع الكتان ستورمونت سيروس (PL) عندما نمت في ظل الشروط الثلاثة مغذيات مختلفة يمكن أن تبقى دون تغيير سواء (وفقا للشروط الرقابة) ، فقد تظهر في ادراج كل النباتات (تحت المواد الغذائية المنخفضة) ، ويكون هذا المنقولة للجيل القادم ، أو لديك الإدراج (أو أجزاء منه) ولكن لا يبدو أن تنتقل عبر الأجيال (تحت المغذيات عالية) ^4. تواتر ظهور هذا الإدراج يدل على أنه في إطار التحديد الإيجابي ، الذي يتسق أيضا مع استجابة النمو في الأجيال اللاحقة. وتستعمل أوراق أو meristems حصادها في مراحل مختلفة من النمو في الحمض النووي الريبي والعزلة. ويستخدم الحمض النووي الريبي لتحديد الاختلاف في التعبير المرتبطة بيئات النمو المختلفة و / أو انه ر حضور / غياب LIS - 1. يتم استخدام الحمض النووي لتحديد تلك المعزولة في النباتات التي الإدراج حدث.

Protocol

1. نمو الكتان في ظل الظروف المحفزة.

1. تمتلئ 5 "القدور مع التربة وتماسكت.
2. تزرع بذور ثلاثة في وعاء عميق ¼ بوصة والتربة ارتفعت أكثر من البذور.
3. ثم تسقى القدور مع 100ML الحلول المناسبة والمغذيات
   1. وعدم التسبب التحكم (C) الظروف استخدام القوة 10/01 ^عشر معجزة - غرو كل أسبوع. حالة عالية من المغذيات (النيتروجين والعلاج) وكان كامل المعجزة قوة تنمو تطبيق الأسبوعية. انخفاض المغذيات -- نباتات سوى مياه الصنبور تطبق في جميع أنحاء نموها. (دورانت 1971 ، Cullis 1980).
4. تزرع النباتات تحت الضوء الطبيعي خلال فصل الصيف. خلال فصل الشتاء وتزرع فيها تحت أضواء الصوديوم مع دائرة الضوء / الظلام 16 / 8 ساعة.
5. على فترات أسبوعية يتم جمع الأوراق وmeristems.
6. يتم تجميد سريع المواد النباتية في النيتروجين السائل.

النتائج

والمورثات three تنمو بمعدلات نسبية مختلفة تبعا للظروف (الشكل 1). ولذلك في ظل ظروف السيطرة على خط رر ينمو بشكل أفضل مع L يجري أكثر نشاطا من S (الشكل 1A). بموجب المواد الغذائية منخفضة (الماء) ، S ينمو بشكل أفضل من أي لتر أو PL (1B الشكل). تحت المغذيات عالية (NPK) L ينمو بشكل أفضل من الذي ينمو فقط رر أفضل قليلا من S (الشكل 1C). ويبين مقارنة بين كل من خطوط نمت تحت العلاجات three اختلاف في الشكل 1 د -- واو رر ينمو بشكل أفضل في ظل ظروف السيطرة (1D الشكل) ، L أفضل تحت المغذيات عالية (الشكل 1E) و S بالمثل في إطار كل من المواد الغذائية العالية وظروف التحكم (الشكل 1F).

هذه البيانات تظهر أنه يمكن التفريق بين الخطوط الثلاثة على أساس نموها في ظل البيئات الثلاث. وتجدر الإشارة أن رر ينمو بشكل أفضل في ظل الظروف السيطرة في الوقت الذي لام ينمو بشكل أفضل في ظل الظروف NPK (الذي كان بفعل ذلك). S ينمو حول نفسها في جميع الحالات الثلاث ، أي أنه غير قادر على الاستفادة من تحسن الظروف المغذيات ولكن من الأفضل قادرة على النمو في ظل الظروف الغذائية منخفضة جدا.

المعلمات النمو والتي لها صلة التفريق بين النباتات وتشمل ارتفاع النبات (ويترافق مع هذا الطول internode ، وهذا هو المسافة بين كل ورقة) ، وحجم ورقة ودرجة التفرع. لرر في ظل ظروف السيطرة على المصنع هو طويل القامة مع فروع وأوراق خضراء كبيرة ومظلمة. بموجب المواد الغذائية منخفضة محطة قصيرة جدا ، والمسافة بين كل ورقة هو أيضا قصيرة جدا ، والأوراق الخضراء الصغيرة والخفيفة. يترك على الحافة والأخضر الداكن من تلك التي في أسفل الساق. تحت المغذيات النباتية عاليا تبدو مشابهة جدا لأنه في ظل ظروف السيطرة إلا أن كلا من الساق الرئيسي ويطلق النار على الجانب أقصر مما كانت عليه في محطات التحكم. لgenotroph كبيرة النباتات تبدو مشابهة جدا لتلك التي رر إلا أن معظم النمو القوي في أقل من المواد الغذائية العالية. مرة أخرى تحت المواد الغذائية منخفضة محطة قصيرة جدا ، والأوراق الخضراء الخفيفة. وgenotroph S ينمو على نحو مماثل في جميع البيئات الثلاث على الرغم من أن يترك هي أخف الخضراء تحت المواد الغذائية منخفضة. ومع ذلك ، في الظروف المغذيات منخفض genotroph S هي أكثر نشاطا من أي من رر أو خطوط L.

2. تتم عمليات الاستخراج والحمض النووي الريبي DNA من meristems الكتان ويترك على حدة. وكان استخدام الحمض النووي الريبي مجموع روش الإعدادية عدة لإخراج الجيش الملكي النيبالي ، وكان يستخدم محطة الدنا DNeasy Qiagen الإعدادية عدة لقلع الحمض النووي.

استخراج الحمض النووي الريبي

1. يتم نقل 3 meristems بالإضافة إلى بعض الأوراق المحيطة من cryovial التخزين في أنبوب إيبندورف وضعها في النيتروجين السائل حتى تكون على استعداد لأرض الواقع.
2. يضاف إلى الأنبوب عقيمة الرمال والأرض الأنسجة باستخدام micropestle حتى الغرامة.
3. يضاف 400 تحلل UL / العازلة ملزم من مجموع روش طقم الإعدادية RNA والأنسجة هو مزيد من الأرض حتى لا كتل مرئية.
4. هو نموذج لvortexed 15 ثانية للمساعدة على تحلل ومن ثم نسج ل1 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة لجمع الرمال والحطام وجدت.
5. يضاف طاف تدور العمود وتتبع بقية التعليمات RNA طقم الإعدادية وفقا لتوجيهات.

الدناز العلاج

1. يضاف 1 / 10 من حجم عينة الحمض النووي الريبي العازلة الدناز 10X.
2. يتم إضافة 30 وحدة من الدناز والمحتضنة رد فعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

عكس النسخ

1. يستخدم تطبيق النظم البيولوجية RNA إلى عدة اتجاهات [كدنا] كما في رد فعل المحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة و 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

ثم يستخدم في [كدنا] أو PCR qPCR

qPCR

تم تنفيذ الخطوة qPCR باستخدام ABI نظام واحد. وأجريت فحوصات في كل ثلاث نسخ عن كل تشغيل. تم استخدام الجينات أكتين كنسخة السيطرة الرقم كأفضل الجين التدبير المنزلي المتاحة.

1. وأضاف الزوج التمهيدي المناسبة لكل أنبوب في 1μl.
2. وقد تضعف [كدنا] إلى تركيز مناسب ويضاف إلى كل 9μl أنبوب
3. وأضاف 10μl من السلطة 2X SYBR MasterMix PCR الأخضر (ABI) ، وإلى كل أنبوب
4. وكان برنامج التضخيم البرنامج :
   • 10 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية
   • 40 دورات 15sec في 95 درجة مئوية ، 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية
   
   الخطوة تمسخ الحرارية للتحقق من نوعية التضخيم
5. تم تحديد مستويات التعبير النسبية في قيمة 2 ^{(CTunknown -- CTactin).}

إعداد DNA

1. يضاف AP1 العازلة من مجموعة النباتات DNeasy Qiagen الإعدادية الحمض النووي إلى 6 يترك مع الرمال العقيمة في أنبوب microfuge. هي الأرض النسيج مع كتل micropestle حتى لا تكون مرئية.
2. يتم اتباع الإرشادات عدة وفقا لتوجيهات.

النتائج

PCR التضخيم من الحمض النووي من أوراق معزولة في مواقع مختلفة على طول الساق يدل على أن ظهور LIS - 1 يحدث في حين أن النباتات تنمو في ظل الظروف المحفزة (4). نتائج qPCR تظهر أن وجود LIS - 1 (أو التغيرات الجرثومية الأخرى المرتبطة الاستقراء) يؤثر على التعبير عن الجينات في المنطقة المجاورة مباشرة للLIS - 1 (الشكل 2). هي كل الجينات الست المبينة في الشكل 2 وأعرب تفاضلي في رر وS مع أربع وجود ارتفاع في التعبير PL (بدون LIS - 1) واثنين من وجود ارتفاع في التعبير S (الذي لديه LIS - 1). لوحة 1 و 2 هي الجينين الأقرب إلى نقطة الإدراج من LIS - 1. وسوف تكون هناك حاجة إلى التعبير عن هذه الجينات في ليالي genotroph الكبيرة (التي كان يسببها التغييرات ولكن ليس لديها LIS - 1) والتعبير في ظل ظروف النمو المختلفة لتحديد أي علاقة سببية بين LIS - 1 والتغيرات التعبير.

الشكل 1. رر ، L S ونمت في ظل الأنظمة الثلاثة مغذيات مختلفة. لوحات أ -- السيطرة ، ب -- المواد الغذائية وانخفاض ج -- النيتروجين. د -- رر ، ه -- S ، و -- لوحات ل د -- و من اليسار إلى اليمين : المواد الغذائية منخفضة ، ومراقبة والنيتروجين. د -- رر ، ه -- L ، F -- S.

التعبير الجيني الرقم 2. حول نقطة الإدراج 1 - LIS. الجينات 1 (المانع للنمو) وعلى الفور 5 'إلى LIs1 والجين 2 (كيب ذات الصلة التي تعتمد على cyclin مثبط كيناز معرف 3" من LIS - 1 ، وغيرها من الجينات على طول نفس سقالة (~ 500KB) التي بنيت من تسلسل الجينوم الكامل الكتان. الرجاء انقر هنا لرؤية أكبر شخصية .

الشكل 3. التكبير PCR للسلطات الوطنية المعينة المستخرجة من أوراق النباتات الفردية من سيروس ستورمونت نمت في ظل الظروف الغذائية منخفضة. تم فصل المنتجات PCR على agarose هلام - TBE 2 ٪. يظهر موقع uninserted في الفريق ، وترد على طرفي موقع إدراجها في ألواح وب ج. وقد تم عزل 6 في فترات أسبوعية مع نموذج 1 في أقرب وقت بعد أن بذر -- عينات نبات 1.

Discussion

الكتان يبدو أن له الجينوم غير مستقر بطبيعته. وهناك عدد من الأصناف التجارية ألياف الكتان تصبح بسرعة غير موحدة عندما نمت لعدة أجيال. الملاحظات نفسها لا يبدو صحيحا بالنسبة للأصناف الكتان النفط. ولذلك يبدو أن هناك وجود ارتباط بين اختيار نوعية الألياف وعدم الاستقرار الجينوم. والناجم عن التغيرات في بيئة الموروثة الكتان وحددت أصلا من خلال التحقيق في الملاحظات الزراعية لنمو المحصول الألياف. تكرار هذه الملاحظات محددة الاختلافات المظهرية والجينومية يثير التساؤل حول كيفية الضغط على البيئة يمكن أن تؤثر على مجموعة من إعادة ترتيب الجينوم التي يمكن أن تحدث. مظهر المتكررة LIS - 1 ردا على بيئات معينة يتفق مع هذا التحول يتم بصورة مباشرة أو غير مباشرة مختارة. نمو خطوط الناجم عن العلاجات المختلفة يشير أيضا إلى تحسين الأداء في ظل الظروف المحفزة ذات الصلة. التغيرات في التعبير يرتبط أيضا مع وجود LIS - 1 مرة أخرى تشير إلى أن هذا الإدراج تؤثر على أداء المصنع. عرض الفيديو يوفر منتدى لرصد التغيرات النباتية المظهري بطريقة يستحيل أن أنقل من خلال المواد المطبوعة التقليدية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S.
5" pots
potting soil
Miracle-Gro
greenhouse
High pressure sodium lights
Liquid nitrogen
Mortar and pestles
Micropestles and microfuge tubes
Thermocycler
Agarose gel electrophoresis equipment
Digital imaging setup
StepOne qPCR module
Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit
Applied Biosystems RNA to cDNA kit
Roche total RNA prep kit