Summary
一些亚麻品种在生长中的基因组变异的基因组和表型变异的一个子集，根据营养应力结果。一个复杂的插入是在一个特定的站点与各种营养制度下的生长和基因表达的变化，围绕本网站。
Abstract
一些亚麻品种，营养的压力，通过修改它们的基因组，这些修改可以通过许多代人继承。此外，这些基因组的变化相关的遗传表型变异1,2。三个不同的营养条件下生长的亚麻品种Cirrus的斯托蒙特（PL）可以保持诱导控制条件下，或成为稳定的修改，或高或低营养条件下的增长或大或小的genotroph分别。每个这些条件下，从最初的增长导致的线条出现在随后的几代人在同等条件下种植时长得更好，尤其是PL线生长最好的控制下，表明在高和低营养生长的植物正在治疗压力。与遗传变化的诱导有关的基因变化之一是插入元素的外观（LIS - 1）3，4，而植物营养应力下的增长。关于这个插入事件，亚麻品种Cirrus的斯托蒙特（PL）三个不同的营养条件下生长时可以保持不变（在控制条件下），插入出现在所有的植物在低营养和这个传播给下一代，或插入（或部分）的出现，但通过几代人（高营养）4传输。插入的外观的频率表明它积极的选择，这也与后代的生长反应一致。叶或分生组织在不同成长阶段的收获是用于DNA和RNA的分离。 RNA是用于确定在不同生长环境和/或T他在场的情况下/ LIS - 1的表达变化。隔离的DNA是用来识别那些发生在其中插入的植物。
Protocol
1。亚麻诱导条件下生长。
- 5“盆用土填充和坚定。
- 每锅三种子种植¼英寸深和土壤的种子落实。
- 盆，然后浇水，适当的营养液百毫升
- 非诱导对照组（C）条件下使用一个1 / 10的力量创造奇迹的格罗每星期。高营养状况（氮磷钾治疗）有充分的力量奇迹增长每星期。低营养 - 植物只有在其整个发展应用的自来水。 （达兰特1971年，库里斯1980年）。
- 自然光下的植物生长在夏季。他们在冬季种植与16 / 8小时，光/暗周期下钠灯。
- 每周一班的叶和分生组织收集。
- 植物材料在液氮速冻。
结果
在3个基因型的生长在不同的条件（图1）的相对比率。因此，控制的条件下的PL线最好用L比S（图1a）的大力增长。在低养分（水），S成长优于L或PL（图1b）。在高养分（氮磷钾）长的增长比PL只增长比S（图1c）稍微好一点。三个不同的治疗下生长的每个线之间的比较显示在图1 D - F。 PL增长最好控制的条件下（图1d），高营养和控制条件下同样大号下最好的高营养（图1e）和S（图1F）。
这些数据表明，基于他们的三种环境下的生长，可以区别的三条线。值得注意的是，PL控制条件下生长最好而L增长最好的下氮磷钾条件（诱导）。在所有这三个条件，即它不能改善营养条件的优势，但在非常低营养条件下能够更好地成长，小号的增长大致相同。
有关植物的分化生长参数包括（间长度，即每一片叶子之间的距离）的株高，叶片大小和分支的程度。对于PL控制条件下的植物是用树枝高大，叶大和深绿色。在低营养的植物很短，每一片叶子之间的距离也很短，叶子是绿色体积小，重量轻。尖的叶子比那些低下来的干较暗的绿色。在高营养的植物看起来非常相似，控制的条件下，除了主茎和方竹笋比对照植株在短。对于大型genotroph的植物看起来非常相似的PL者，但最具活力的增长下的高营养。下再次低营养的植物很短，浅绿色的叶子。同样的S genotroph增长在所有三个环境虽然在低养分较轻的绿色叶片。然而，在低营养条件下的S genotroph是严厉得多的PL或L线之一。
2。 RNA和DNA的提取亚麻分生组织和叶分别进行。罗氏公司的总RNA制备试剂盒用于RNA的提取和Qiagen公司DNeasy植物DNA制备试剂盒的DNA提取使用。
RNA的提取
- 3分生组织中加上一些周边叶移动存储离心管，Eppendorf管中，并置于液氮，直至地面。
- 添加到无菌砂管和地面使用，直到精细micropestle组织。
- 400 UL罗氏总RNA准备试剂盒的裂解/结合缓冲液中添加和组织进一步的地面，直到没有团块可见。
- 样品振荡15秒，以帮助裂解和纺1分钟13,000转，收集砂和任何杂物。
- 上清液加入离心柱，随后其余的RNA制备试剂盒说明书的指示。
DNA酶处理
- 10X DNA酶缓冲液的样品量的1 / 10的RNA。
- 30个单位的DNA酶是添加反应是在37℃孵育° C为30分钟，70℃5分钟。
反转录
- 美国应用生物系统公司的RNA的cDNA试剂盒是用来为每方向，反应孵育在37℃，1小时和95 ° C为5分钟。
然后用PCR或为定量PCR的cDNA
定量PCR
定量PCR进行使用ABI步骤的一个系统。在每次运行时，所有检测一式三份。肌动蛋白基因被用来作为一个拷贝数控制最好的看家基因。
- 适当的引物被添加到每个试管中加入1μl。
- 的cDNA稀释至适当浓度和9μl添加到每个管
- 2x电源SYBR GREEN PCR反应试剂（ABI）的10μL，被添加到每个管
- 该计划扩增程序是：
- 10分钟在95 ° C
- 15秒40的周期在95℃，在60℃1分钟
热变性步骤，以验证扩增的特异性 - 相对表达水平进行了测定值2（CTunknown - CTactin）。
DNA的制备
- Qiagen公司DNeasy植物DNA制备试剂盒缓冲AP1的是添加到6叶无菌砂在离心管。该组织是地面与micropestle，直到没有团块可见。
- 按照试剂盒说明书。
结果
从各个岗位沿干叶中分离出DNA PCR扩增表明，LIS - 1的外观发生，而植物的诱导条件下（4）发展。定量PCR结果显示，LIS - 1（或其他基因组相关的变化与感应）的存在会影响基因的表达在紧邻LIS - 1（图2）。在图2所示的六个基因差异表达的都是四份报告具有较高的表达在PL（不含LIS - 1）和2个具有较高的表达（确实有LIS - 1）在S PL和S。面板1和2 LIS - 1插入点最接近的两个基因。将需要在大genotroph（这已经改变而引起的，但没有LIS - 1）和不同的生长条件下的表达，这些基因的表达，以确定任何LIS - 1表达的变化之间的因果关系。
图1。PL，L和S三种不同的营养制度下成长。面板 - 控制，B - 低营养和C - 三元复合肥。 D - PL，E - S，F - 属面板ð - F从左至右：低营养，控制和NPK。 D - PL，E - L，F - S。
图2。LIS - 1插入点周围的基因表达。基因1（生长抑制剂）5'立即LIs1和LIS - 1基因2（硖相关细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂ID 3“的其他基因，沿着相同的脚手架从内置（〜500KB）完整的亚麻基因组序列。请点击这里查看大图 。
图3：从个人的斯托蒙特Cirrus的低营养条件下生长的植物叶中提取的DNA的PCR扩增。 2％的琼脂糖TBE凝胶分离PCR产物。 uninserted网站事务委员会所示，两端插入网站显示面板B和C叶样品1 - 6被隔离在样品1，播种后最早每周一班。
Discussion
亚麻出现，有一个内在的不稳定性的基因组。一些商业纤维亚麻品种迅速成为非均匀时为几代人成长。不会出现相同的看法持有真实的胡麻品种。因此，似乎是一个协会之间的纤维品质的选择和基因组不稳定。环境引起的遗传改变亚麻纤维作物生长的农艺性状观察的调查最初是通过确定。这些重复的意见，提出了具体的表型和基因变异的环境压力如何影响可能发生的基因重排的套件的问题。 LIS - 1在针对特定环境中重复出现这种突变直接或间接地选择是一致的。各种治疗引起的线条的增长也表明相关的诱导条件下提高性能。表达的变化，也再次LIS - 1的存在表明，此插入，影响植物的性能。视频演示，提供了一个观察植物的表型变化的方式不可能通过传统的印刷材料传达论坛。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
