Summary
पोषक तत्व तनाव के परिणाम के तहत कुछ सन किस्मों जीनोम और प्ररूपी भिन्नता के एक सबसेट के भीतर जीनोमिक विभिन्नता में बढ़ते. एक विशिष्ट साइट पर एक जटिल सम्मिलन विभिन्न पोषक तत्वों की व्यवस्थाओं के तहत विकास के साथ और जीन अभिव्यक्ति में इस साइट के आसपास परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है.
Abstract
कुछ सन किस्मों उनके जीनोम को संशोधित और इन संशोधनों को कई पीढ़ियों के माध्यम से विरासत में मिला जा सकता है द्वारा पोषक तत्व तनाव का जवाब. इसके अलावा इन जीनोमिक परिवर्तन के साथ जुड़े प्ररूपी विविधताओं 1,2 पैतृक रहे हैं. सन किस्म Stormont सिरस (pl) जब तीन विभिन्न पोषक तत्वों की शर्तों के तहत हो या तो inducible रहना (नियंत्रण की शर्तों के तहत) कर सकते हैं, या stably या तो उच्च या कम पोषक तत्वों की शर्तों के तहत विकास से बड़े या छोटे genotroph क्रमशः संशोधित हो. इन शर्तों में से प्रत्येक के तहत प्रारंभिक विकास से उत्पन्न लाइनों के लिए बेहतर हो जाना जब बाद की पीढ़ियों में एक ही परिस्थितियों में हो दिखाई देते हैं, विशेष रूप से Pl लाइन नियंत्रण दर्शाता है कि दोनों उच्च और कम पोषक तत्वों के तहत पौधों से बढ़ के तहत कर रहे हैं उपचार के तहत सबसे अच्छी होती है तनाव. जीनोमिक परिवर्तन है कि पैतृक परिवर्तन की प्रेरण के साथ जुड़े रहे हैं की एक प्रविष्टि तत्व की उपस्थिति (एलआईएस 1) 3, 4 है, जबकि पौधों को पोषक तत्व तनाव के तहत बढ़ रहे हैं. इस प्रविष्टि की घटना के लिए सम्मान के साथ, सन किस्म Stormont सिरस (pl) जब तीन विभिन्न पोषक तत्वों की शर्तों के तहत हो या तो अपरिवर्तित ही रहेंगे (नियंत्रण की शर्तों के तहत) है, सम्मिलन सभी पौधों में प्रकट (कम पोषक तत्वों के तहत) और इस प्रेषित अगली पीढ़ी के लिए, या सम्मिलन (या के कुछ हिस्सों) दिखाई देते हैं लेकिन पीढ़ियों (उच्च पोषक तत्वों के तहत) 4 के माध्यम से नहीं फैलता. इस प्रविष्टि की उपस्थिति की आवृत्ति इंगित करता है कि यह सकारात्मक चयन, जो भी बाद की पीढ़ियों में वृद्धि प्रतिक्रिया के साथ संगत है के तहत है. विकास के विभिन्न चरणों में काटा पत्तियां या meristems डीएनए और आरएनए अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाता है. शाही सेना के लिए विभिन्न विकास वातावरण और / या टी वह उपस्थिति / एलआईएस-1 के अभाव के साथ जुड़े अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है. पृथक डीएनए जिसमें सम्मिलन हुआ है उन पौधों की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है.
Protocol
1. सन के उत्प्रेरण शर्तों के तहत विकास.
- 5 "बर्तन मिट्टी से भर रहे हैं और पुष्टि की.
- बर्तन प्रति तीन बीज ¼ इंच गहरा लगाए हैं और मिट्टी के बीज से अधिक पुष्टि की.
- बर्तन तो 100ml उपयुक्त पोषक तत्व समाधान के साथ पानी पिलाया जाता है
- गैर उत्प्रेरण नियंत्रण की स्थिति (सी) हर हफ्ते 1 / 10 वें ताकत चमत्कार Gro का उपयोग करें . उच्च पोषक तत्व हालत (NPK उपचार) पूरी ताकत चमत्कार था साप्ताहिक लागू बढ़ो. कम पोषक तत्व - पौधों केवल नल उनके विकास भर में लागू पानी था. (1971 Durrant, 1980 Cullis).
- प्राकृतिक प्रकाश के तहत पौधों की गर्मियों के दौरान बड़े हो रहे हैं. सर्दियों के दौरान वे सोडियम लाइट के तहत 16 / 8 घंटे / प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ बड़े हो रहे हैं.
- साप्ताहिक अंतराल पर पत्तियों और meristems एकत्र कर रहे हैं.
- संयंत्र सामग्री त्वरित तरल नाइट्रोजन में जमे हुए है.
परिणाम
तीन जीनोटाइप अलग रिश्तेदार शर्तों (चित्रा 1) के आधार पर दरों पर बढ़ता है. इसलिए नियंत्रण की शर्तों के तहत Pl लाइन एल अधिक एस (चित्रा 1a) की तुलना में जोरदार होने के साथ सबसे अच्छी होती है. कम पोषक तत्वों के तहत (जल), एस या तो एल या Pl (चित्रा 1b) से बेहतर बढ़ता है. (NPK) एल के तहत उच्च पोषक तत्व Pl जो केवल थोड़ा एस (चित्रा -1 सी) से बेहतर बढ़ता है की तुलना में बेहतर बढ़ता है. तीन भिन्न उपचार के तहत हो लाइनों में से प्रत्येक के बीच एक तुलना घ चित्रा 1 में दिखाया गया है - एफ Pl नियंत्रण (चित्रा 1d) शर्तों के तहत सबसे अच्छा उच्च पोषक तत्व (चित्रा 1e) और एस के तहत एल सबसे अच्छा इसी तरह दोनों उच्च पोषक तत्व और नियंत्रण की स्थिति के तहत (चित्र 1f) बढ़ता
ये आंकड़े बताते हैं कि तीन लाइनों तीन वातावरण के तहत उनके विकास के आधार पर भेदभाव किया जा सकता है है. ध्यान से है कि Pl नियंत्रण की शर्तों के तहत सबसे अच्छी होती है, जबकि एल NPK (जिसके तहत यह प्रेरित किया गया था) शर्तों के तहत सबसे अच्छी होती है. सभी तीन स्थितियों, कि है, यह सुधार पोषक शर्तों के लाभ उठाने में सक्षम नहीं है, लेकिन बेहतर करने के लिए बहुत कम पोषक तत्वों की शर्तों के तहत विकसित करने में सक्षम है में उसी के बारे में बढ़ता है.
विकास पैरामीटर है कि पौधों के भेदभाव के लिए प्रासंगिक हैं संयंत्र (और इस internode लंबाई है, कि प्रत्येक पत्ती के बीच की दूरी है साथ जुड़े) ऊंचाई, पत्ते के आकार और शाखाओं में बंटी की डिग्री शामिल हैं. Pl के लिए नियंत्रण की शर्तों के तहत संयंत्र शाखाओं के साथ लंबा है और पत्तियों के बड़े और गहरे हरे रंग की हैं. कम पोषक तत्वों के तहत संयंत्र बहुत ही कम है, प्रत्येक पत्ती के बीच की दूरी भी बहुत कम है और पत्तियों के छोटे और हल्के हरे रंग हैं. नोक पर पत्तियों स्टेम नीचे कम उन से गहरा हरा कर रहे हैं. उच्च पोषक तत्वों के तहत संयंत्र के नियंत्रण की शर्तों के तहत सिवाय इसके कि दोनों मुख्य स्टेम और साइड शूटिंग नियंत्रण पौधों की तुलना में कम कर रहे हैं कि बहुत समान दिखता है. बड़े genotroph के लिए पौधों Pl की है कि उच्च पोषक तत्वों के तहत सबसे जोरदार में वृद्धि के अलावा उन लोगों के लिए बहुत इसी तरह लग रहे हैं. फिर कम पोषक तत्वों के तहत संयंत्र बहुत ही कम है और प्रकाश हरी पत्तियों की है. एस genotroph सभी तीन वातावरण में इसी तरह बढ़ता है, हालांकि पत्ते कम पोषक तत्वों के तहत हल्का हरे रंग की हैं. हालांकि, कम पोषक तत्व की स्थिति में एस genotroph Pl या एल लाइनों के दोनों से अधिक जोरदार है.
2. सन meristems और पत्तियों से शाही सेना और डीएनए extractions अलग कर रहे हैं. Roche कुल शाही सेना तैयार करने का किट आरएनए extractions और Qiagen DNeasy संयंत्र डीएनए तैयार करने का किट डीएनए extractions के लिए इस्तेमाल किया गया था के लिए इस्तेमाल किया गया था.
शाही सेना एक्सट्रैक्शन
- 3 meristems प्लस कुछ आसपास के पत्ते का भंडारण cryovial से Eppendorf ट्यूब में चले गए हैं और तरल नाइट्रोजन में रखा जब तक जमीन के लिए तैयार है.
- बाँझ रेत ट्यूब को जोड़ा जाता है और ऊतक ठीक है जब तक एक micropestle का उपयोग करने के लिए जमीन है.
- 400 उल lysis / Roche कुल शाही सेना तैयार करने का किट से बाध्यकारी बफर जोड़ी जाती है और ऊतक और अधिक जमीन है जब तक कोई clumps दिखाई दे रहे हैं.
- नमूना vortexed सेकंड lysis 15 के लिए सहायता करने के लिए और फिर 13,000 रेत और किसी भी मलबे इकट्ठा rpm पर 1 मिनट के लिए काता है.
- सतह पर तैरनेवाला स्तंभ स्पिन जोडी है और शाही सेना तैयार करने का किट निर्देशों के बाकी निर्देशन के रूप में पीछा कर रहे हैं.
DNase उपचार
- 10X DNase बफर के 1 / 10 आरएनए नमूना मात्रा जोड़ा जाता है.
- DNase की 30 इकाइयों को जोड़ा और प्रतिक्रिया 37 पर incubated है ° सी के लिए 30 मिनट और 70 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए.
रिवर्स प्रतिलेखन
- एप्लाइड Biosystems सीडीएनए किट के लिए शाही सेना के प्रति दिशा - निर्देशों के लिए, 37 में incubated प्रतिक्रिया डिग्री सेल्सियस 1 घंटे और 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए. के रूप में प्रयोग किया जाता है
सीडीएनए तो पीसीआर में या qPCR के लिए प्रयोग किया जाता है
qPCR
qPCR एक अबी चरण एक प्रणाली का उपयोग किया था. सभी assays तीन प्रतियों में प्रत्येक रन पर प्रदर्शन किया गया. actin जीन एक प्रतिलिपि संख्या पर नियंत्रण के रूप में के रूप में इस्तेमाल किया गया थाउपलब्ध सर्वोत्तम गृह व्यवस्था जीन.
- उपयुक्त प्राइमर जोड़ी 1μl में प्रत्येक ट्यूब करने के लिए जोड़ा गया है.
- सीडीएनए उपयुक्त एकाग्रता और 9μl पतला था प्रत्येक ट्यूब करने के लिए जोड़ा
- 10μl 2x पावर SYBR ग्रीन पीसीआर MasterMix (अबी) और प्रत्येक ट्यूब को जोड़ा गया
- कार्यक्रम प्रवर्धन कार्यक्रम था:
- 95 पर 10 मिनट डिग्री सेल्सियस
- 95 पर 40 15sec के चक्र डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट
थर्मल विकृतीकरण प्रवर्धन विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए कदम - रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर 2 (- CTactin CTunknown) के मूल्य के द्वारा निर्धारित किया गया है .
डीएनए की तैयारी
- बफर AP1 Qiagen DNeasy संयंत्र डीएनए तैयार करने का किट से एक microfuge ट्यूब में बाँझ रेत के साथ 6 पत्तियों को जोड़ा जाता है. ऊतक micropestle के साथ जमीन है जब तक कोई clumps दिखाई दे रहे हैं.
- किट निर्देशों का पालन कर रहे हैं के रूप में निर्देशन.
परिणाम
स्टेम साथ विभिन्न पदों पर पत्तियों से पृथक डीएनए पीसीआर प्रवर्धन से दर्शाता है कि एलआईएस-1 की उपस्थिति होती है, जबकि पौधों उत्प्रेरण शर्तों (4) के तहत बढ़ रहे हैं. qPCR परिणाम बताते हैं कि एलआईएस-1 (या अन्य जीनोमिक परिवर्तन प्रेरण के साथ जुड़े) की उपस्थिति एलआईएस-1 के तत्काल आसपास (चित्रा 2) में जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है. छह चित्रा 2 में दिखाया गया है जीन के सभी चार पी एल में उच्च अभिव्यक्ति (एलआईएस-1 के बिना) और दो एस में उच्च अभिव्यक्ति (जो एलआईएस-1 है) होने के साथ विभिन्न प्रकार हैं Pl और एस में व्यक्त किया. पैनल 1 और 2 के दो जीनों एलआईएस-1 की प्रविष्टि बिंदु को निकटतम हैं. बड़े (जो परिवर्तन प्रेरित किया है, लेकिन करता एलआईएस-1) और विभिन्न विकास शर्तों के तहत अभिव्यक्ति genotroph में इन जीन की अभिव्यक्ति एलआईएस-1 और अभिव्यक्ति में परिवर्तन के बीच किसी भी कारण रिश्ता तय की जरूरत होगी.
चित्रा 1. Pl, एल, और एस तीन विभिन्न पोषक तत्वों की व्यवस्थाओं के तहत हो. पैनलों एक - नियंत्रण, ख - कम पोषक तत्वों और ग - NPK. घ - Pl, ई - एस, च - एल घ पैनलों - बाएँ से दाएँ च: कम पोषक तत्वों, नियंत्रण और NPK. डी - Pl, ई - एल, एफ - एस
चित्रा 2. एलआईएस-1 की प्रविष्टि के बिंदु के आसपास जीन अभिव्यक्ति. 1 जीन (विकास के अवरोध करनेवाला) तुरंत 5 'LIs1 करने के लिए और 2 एलआईएस-1 (रात बिताने का स्थान से संबंधित cyclin निर्भर kinase अवरोध करनेवाला 3 आईडी "जीन अन्य जीन एक ही पाड़ (~ 500KB) से बनाया सब साथ हैं पूरा सन जीनोम अनुक्रम. कृपया यहाँ क्लिक करने के लिए एक बड़ा आंकड़ा देखें .
चित्रा 3 कम पोषक तत्वों की शर्तों के तहत हो Stormont सिरस के पौधों के व्यक्तिगत पत्तियों से निकाले DNAs पीसीआर amplifications. पीसीआर उत्पादों को एक 2% जेल agarose - TBE पर अलग हो गए थे. uninserted साइट पैनल में दिखाया गया है, सम्मिलित साइट के दोनों सिरों पैनलों ख और ग. में दिखाया जाता है पत्ता 1 नमूनों - 6 1 नमूना बुवाई के बाद जल्द से जल्द किया जा रहा है के साथ साप्ताहिक अंतराल पर अलग थे.
Discussion
सन के लिए एक स्वाभाविक अस्थिर जीनोम है प्रकट होता है है. वाणिज्यिक फाइबर सन किस्मों का एक संख्या तेजी से गैर वर्दी हो जब कुछ पीढ़ियों के लिए हो. एक ही टिप्पणियों के लिए तेल सन किस्मों के लिए सही पकड़ नहीं दिखाई देते. इसलिए वहाँ फाइबर गुणवत्ता और जीनोम अस्थिरता के लिए चयन के बीच एक संघ प्रतीत होता है. पर्यावरण प्रेरित सन में परिवर्तन पैतृक थे मूल रूप से फाइबर फसल के विकास के कृषिशास्रीय टिप्पणियों की जांच के माध्यम से की पहचान की. विशिष्ट प्ररूपी और जीनोमिक विविधताओं के इन repeatable टिप्पणियों कैसे पर्यावरण के तनाव जीनोमिक rearrangements के सुइट है कि हो सकता है प्रभावित कर सकते हैं का सवाल उठाती है. विशेष वातावरण के लिए जवाब में एलआईएस-1 दोहराया उपस्थिति इस उत्परिवर्तन सीधे या परोक्ष रूप से चयनित के साथ संगत है. विभिन्न उपचार से प्रेरित लाइनों के विकास को भी प्रासंगिक उत्प्रेरण शर्तों के तहत एक बेहतर प्रदर्शन का संकेत देता है. अभिव्यक्ति में परिवर्तन भी फिर एलआईएस-1 की उपस्थिति के साथ जुड़े इंगित करता है कि इस प्रविष्टि संयंत्र के प्रदर्शन को प्रभावित है. वीडियो प्रस्तुति एक असंभव तरीके से संयंत्र प्ररूपी परिवर्तन देख पारंपरिक मुद्रित सामग्री के माध्यम से संप्रेषित करने के लिए एक मंच प्रदान करता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
