Summary
Crescente alcune varietà di lino sotto i risultati dello stress nutrienti in variazione genomica all'interno di un sottoinsieme del genoma e della variazione fenotipica. Un complesso di inserimento in un sito specifico viene associata a una crescita sotto vari regimi di nutrienti e con i cambiamenti nell'espressione genica intorno a questo sito.
Abstract
Alcune varietà di lino rispondere alle sollecitazioni dei nutrienti, modificando il loro genoma e queste modifiche possono essere ereditate attraverso molte generazioni. Anche associata a questi cambiamenti genomici sono ereditarie fenotipica 1,2 variazioni. La varietà di lino Stormont Cirrus (Pl), se coltivate in tre diverse condizioni di nutrienti possono restare inducibile (nelle condizioni di controllo), o diventare stabilmente modificate sia al genotroph grande o piccolo da una crescita in condizioni di nutrienti alto o basso, rispettivamente. Le linee derivanti dalla crescita iniziale in ciascuno di tali condizioni sembrano crescere meglio se coltivate nelle stesse condizioni nelle generazioni successive, in particolare la linea Pl cresce meglio sotto il trattamento di controllo che indica che le piante che crescono in entrambi i nutrienti di alta e bassa sono in fase di stress. Uno dei cambiamenti genomiche che sono associati con l'induzione di cambiamenti ereditabili è la comparsa di un elemento di inserimento (LIS-1) 3, 4, mentre le piante crescono sotto lo stress dei nutrienti. In relazione a questo evento di inserimento, la varietà di lino Stormont Cirrus (Pl), se coltivate in tre diverse condizioni di nutrienti possono restare invariati (alle condizioni di controllo), hanno l'inserimento appare in tutte le piante (sotto nutrienti basso) e hanno trasmesso questo alla prossima generazione, o hanno l'inserimento (o parti di essa), ma non sembrano essere trasmessi attraverso le generazioni (sotto i nutrienti alto) 4. La frequenza della comparsa di questa inserzione indica che è in fase di selezione positiva, che è anche coerente con la risposta di crescita nelle generazioni successive. Foglie o meristemi raccolte nelle varie fasi di crescita sono utilizzate per l'isolamento del DNA e RNA. L'RNA viene utilizzato per identificare variazioni nell'espressione associate con gli ambienti di crescita diversi e / o t ha presenza / assenza di LIS-1. Il DNA isolato viene utilizzato per identificare quelle piante in cui l'inserimento è avvenuto.
Protocol
1. Crescita di lino in condizioni che inducono.
- 5 "vasi sono pieni di terreno e rassodata.
- Tre semi per vaso sono piantati ¼ di pollice profondo e il terreno confermato sopra i semi.
- I vasi vengono poi innaffiato con 100 ml di soluzioni appropriate nutrienti
- La mancata induzione di controllo (C) le condizioni di utilizzare una forza 1 / 10 di Miracle-Gro ogni settimana. La condizione di alta nutrienti (NPK trattamento) aveva Miracle Grow piena forza applicata settimanale. Povero di nutrienti - piante solo acqua del rubinetto fosse applicata in tutta la loro crescita. (Durrant 1971, Cullis 1980).
- Le piante sono coltivate in presenza di luce naturale durante l'estate. Durante l'inverno sono cresciuti sotto le luci di sodio con un 16 / 8 ore ciclo luce / buio.
- Ad intervalli settimanali foglie e meristemi sono raccolti.
- Il materiale vegetale è veloce congelati in azoto liquido.
Risultati
I tre genotipi crescere a tassi differenti rispetto a seconda delle condizioni (Figura 1). Pertanto in condizioni di controllare la linea Pl cresce meglio con L essendo più vigoroso di S (Figura 1a). Sotto nutrienti bassa (acqua), S cresce meglio L o Pl (Figura 1b). Sotto nutrienti alta (NPK) L cresce meglio di Pl che cresce solo di poco migliore di S (Figura 1c). Un confronto tra ciascuna delle linee cresciuti sotto i tre trattamenti diversi è illustrato nella figura 1 d - f. Pl cresce meglio in condizioni di controllo (Figura 1d), L migliori sotto nutrienti alta (figura 1e) e S in modo simile in entrambe le sostanze nutritive elevate e condizioni di controllo (Figura 1f).
Questi dati dimostrano che le tre linee possono essere differenziate in base alla loro crescita sotto i tre ambienti. Di nota è che Pl cresce meglio nelle condizioni di controllo, mentre L cresce meglio nelle condizioni di NPK (alle quali è stata indotta). S cresce di circa lo stesso in tutte e tre le condizioni, cioè, non è in grado di approfittare delle migliori condizioni di nutrienti, ma è meglio in grado di crescere in condizioni di nutrienti molto bassi.
I parametri di crescita che sono rilevanti per la differenziazione delle piante includono l'altezza della pianta (e associati a questo la lunghezza internodo, cioè la distanza tra ogni foglia), le dimensioni delle foglie e il grado di ramificazione. Per Pl in condizioni di controllare l'impianto è alto con rami e le foglie sono verdi grandi e scuri. Sotto nutrienti bassa l'impianto è molto breve, la distanza tra ogni foglia è anche molto breve e le foglie sono verdi piccoli e leggeri. Le foglie in punta sono più scuri di quelli verdi più in basso lo stelo. Sotto nutrienti alta la pianta sembra molto simile a quella in condizioni di controllo, tranne che sia il fusto principale e germogli laterali sono più corti negli impianti di controllo. Per la genotroph grandi le piante sembrano molto simili a quelle di Pl, tranne che la crescita più vigorosa in meno di sostanze nutritive elevate. Ancora una volta sotto i nutrienti a basso la pianta è molto breve e ha foglie verde chiaro. Il genotroph S cresce in modo simile in tutti e tre gli ambienti, anche se le foglie sono verde più chiaro sotto i nutrienti contenuti. Tuttavia, in condizioni di scarsa nutrienti la genotroph S è molto più vigorosa rispetto ad entrambi i Pl o linee L.
2. Estrazioni di RNA e DNA da meristemi di lino e le foglie sono fatte separatamente. La Roche RNA totale di preparazione kit è stato utilizzato per le estrazioni di RNA e DNA Qiagen DNeasy impianto di preparazione kit è stato utilizzato per l'estrazione del DNA.
Estrazione di RNA
- 3 meristemi, più alcune foglie circostanti sono spostati da provetta Microbank ™ stoccaggio nel tubo eppendorf e messo in azoto liquido fino al momento di essere a terra.
- Sabbia sterile viene aggiunto al tubo e il tessuto è a terra con una multa fino a micropestle.
- 400 lisi ul / buffer vincolante da Roche RNA totale di preparazione kit è aggiunto e il tessuto è ulteriore terreno fino a quando non sono visibili grumi.
- Campione è in agitazione per 15 secondi per aiutare lisi e poi filata per 1 minuto a 13.000 giri per raccogliere sabbia e detriti.
- Surnatante si aggiunge a girare colonna e il resto della preparazione RNA istruzioni del kit sono seguite le istruzioni.
DNAsi trattamento
- 1 / 10 del volume campione di RNA di 10X tampone DNAsi è aggiunto.
- 30 unità di DNAsi si aggiunge e la reazione viene incubata a 37 ° C per 30 min e 70 ° C per 5 min.
Trascrizione inversa
- Applied Biosystems RNA a cDNA kit è utilizzato secondo le istruzioni, la reazione di incubazione a 37 ° C per 1 ora e 95 ° C per 5 minuti.
Il cDNA viene poi utilizzato in PCR o per qPCR
qPCR
qPCR è stata effettuata utilizzando un passaggio ABI Un unico sistema. Tutti i test sono stati eseguiti in triplicato a ogni esecuzione. Il gene actina è stata usata come controllo, come numero di copiela migliore gene housekeeping disponibili.
- La coppia di primer appropriato è stato aggiunto ad ogni provetta in 1ml.
- Il cDNA è stato diluito alla concentrazione appropriata e 9μl aggiunto ad ogni provetta
- 10μl del Potere 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) e 'stato aggiunto ad ogni provetta
- Il programma di amplificazione programma è stato:
- 10 minuti a 95 ° C
- 40 cicli di 15 sec a 95 ° C, 1 min a 60 ° C
Denaturazione termica passo per verificare la specificità di amplificazione - I livelli di espressione relativi sono stati determinati dal valore di 2 (CTunknown - CTactin).
Estrazione del DNA
- Buffer AP1 da impianto Qiagen DNeasy DNA preparazione kit è aggiunto 6 foglie con sabbia sterile in una provetta per microcentrifuga. Il tessuto è a terra con micropestle grumi fino a quando non sono visibili.
- Le istruzioni del kit sono seguite le istruzioni.
Risultati
Amplificazione PCR dal DNA isolato dalle foglie in diverse posizioni lungo il fusto dimostra che la comparsa di LIS-1 si verifica durante le piante crescono in condizioni che inducono (4). I risultati qPCR mostrano che la presenza di LIS-1 (o altre variazioni genomiche associate alla induzione) influenza l'espressione dei geni nelle immediate vicinanze della LIS-1 (Figura 2). I sei geni mostrato nella Figura 2 sono differenzialmente espressi in Pl e S quattro di essi avevano l'espressione più alta in PL (senza LIS-1) e due che hanno maggiore espressione in S (che ha LIS-1). Pannello 1 e 2 sono i due geni più vicino al punto di inserimento di LIS-1. L'espressione di questi geni s in genotroph di grandi dimensioni (che ha avuto cambiamenti indotti, ma non ha LIS-1) e l'espressione in condizioni di crescita diversi saranno necessari per determinare una relazione causale tra LIS-1 e le variazioni di espressione.
Figura 1. Pl, L e S cresciuto sotto tre diversi regimi di nutrienti. Pannelli a - controllo, b - nutrienti bassa e c - NPK. d - Pl, e - S, f - L. Pannelli d - f da sinistra a destra: nutrienti basso, controllo e NPK. D - Pl, e - L, F - S.
Figura 2. Espressione genica attorno al punto di inserimento di LIS-1. Gene 1 (inibitore di crescita) è immediatamente 5 'di LIS1 e il gene 2 (Kip legate ciclina-dipendente id inibitore della chinasi 3 "della LIS-1. I geni altre sono tutte lungo la stessa impalcatura (~ 500kb) costruito dal sequenza completa del genoma di lino. Si prega di cliccare qui per vedere una figura più grande .
Figura 3. Amplificazioni PCR di DNA estratto dalle foglie di piante singole di Stormont Cirrus coltivate in condizioni di scarsa nutrienti. I prodotti di PCR sono stati separati su un 2% di agarosio TBE-gel. Il sito uninserted è mostrato in un pannello, le due estremità del sito inseriti sono mostrati in pannelli B e C. I campioni di foglie 1-6 sono stati isolati a intervalli settimanali con il campione 1 è il primo dopo la semina.
Discussion
Lino sembra avere un genoma intrinsecamente instabile. Un certo numero di varietà commerciali lino tessile rapidamente diventato non uniforme quando destinata alla produzione di poche generazioni. Le stesse osservazioni non sembrano valere per varietà di lino l'olio. Quindi sembra esserci un'associazione tra la selezione per la qualità delle fibre e l'instabilità del genoma. Il indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella lino sono stati inizialmente identificati attraverso l'indagine delle osservazioni agronomiche della crescita del raccolto fibra. Queste osservazioni ripetibili di specifiche varianti fenotipiche e genomica solleva la questione di come lo stress ambientale può influenzare la suite di riarrangiamenti genomici che possono verificarsi. La comparsa ripetuta di LIS-1 in risposta a particolari ambienti è coerente con questa mutazione sia direttamente o indirettamente selezionato. La crescita delle linee indotta da trattamenti vari indica anche un miglioramento delle prestazioni in condizioni che inducono rilevanti. Le variazioni di espressione anche associata con la presenza di LIS-1 indica ancora una volta che questo inserimento influire sulle prestazioni degli impianti. Il video di presentazione fornisce un forum per osservare i cambiamenti fenotipici impianto in maniera impossibile da trasmettere attraverso i tradizionali materiale stampato.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
