Summary
Genom ve fenotipik varyasyon bir alt kümesi içinde genomik değişimi besin stres altında bazı keten çeşitleri Büyüyen. Belirli bir yerinde karmaşık bir ekleme çeşitli besin rejimler altında büyüme ile bu sitede çevresinde gen ekspresyonu değişiklikleri ile ilişkilidir.
Abstract
Bazı keten çeşitleri genom değiştirme ve birçok nesiller boyunca bu değişiklikler kalıtsal olabilir besin strese cevap verir. Ayrıca bu genomik değişiklikler ile ilişkili fenotipik varyasyon kalıtsal 1,2. Üç farklı besin koşullar altında yetiştirilen keten çeşitli Stormont Cirrus (Pl) ya da (kontrol koşullar altında) indüklenebilir kalır, ya da stabil bir şekilde, sırasıyla, yüksek ya da düşük besin koşullar altında büyüme ile büyük veya küçük genotroph ya da değiştirilmiş haline. Bu koşulların her birinin altında ilk büyüme kaynaklanan çizgiler daha sonraki nesillere de aynı şartlar altında yetiştirilen büyümeye Pl hattı, özellikle yüksek ve düşük besin hem de altında büyüyen bitkilerin altında olduğunu belirten kontrol tedavi altında en iyi yetişir stres. Bitkilerin besin stres altında büyürken kalıtsal değişikliklerin indüksiyonu ile ilişkili genomik değişikliklerin biri bir ekleme elemanının görünümünü (LIS-1) 3, 4. Bu ekleme olayı ile ilgili olarak, keten çeşitli Stormont Cirrus (Pl) üç farklı besin koşullar altında yetiştirilen ya (kontrol koşullar altında) değişmeden kalır, ekleme, tüm bitkilerin (düşük besinleri altında) ve bu yolla bulaşan yeni nesil, veya ekleme (veya parçaları) görünür ancak nesiller (yüksek besin altında) 4 üzerinden aktarılabilir. Bu ekleme görünümünü frekans, aynı zamanda sonraki nesillere büyüme yanıtı ile tutarlı pozitif seçimi, altında olduğunu gösterir. Büyümenin çeşitli aşamalarında hasat edilen yapraklar veya meristemlerde DNA ve RNA izolasyonu için kullanılır. RNA çeşitli büyüme ortamları ve / veya t LIS-1 varlığı / yokluğu ile ilgili ifadesinde varyasyonu tanımlamak için kullanılır. Izole edilmiş DNA ekleme oluştu bu bitkilerin tanımlamak için kullanılır.
Protocol
1. Indükleyici koşullar altında keten Büyüme.
- 5 "tencere toprakla doldurulur ve onaylanır.
- Pot başına üç tohum ekildi ve ¼ inç derin toprak, tohum üzerinde onaylanır.
- Tencere sonra uygun besin çözümler 100ml ile sulanan
- Olmayan inducing kontrolü (C) koşulları her hafta 1 / 10 th gücü Miracle-Gro kullanın. Yüksek besin durumu (NPK tedavi) tam gücü Mucize haftalık uygulanan yetiştirin. Düşük besin - bitkiler sadece kendi büyüme boyunca uygulanan musluk suyu vardı. (Durrant 1971, Cullis 1980).
- Bitkiler, yaz aylarında doğal ışık altında yetiştirilir. Kış aylarında 16 / 8 saat aydınlık / karanlık döngüsü ile sodyum ışıkları altında yetiştirilir.
- Haftalık aralıklarla toplanan yaprakları ve meristemlerde.
- Bitki materyali hızlı bir sıvı nitrojen içinde dondurulur.
Sonuçlar
Üç genotipleri (Şekil 1) koşullara bağlı olarak farklı nispi oranları büyür. Bu nedenle kontrol koşulları altında Pl hattı L, S (Şekil 1a) daha kuvvetli olan en iyi yetişir. Düşük besinleri altında (su), S L veya Pl (Şekil 1b) ya da daha iyi yetişir. Yüksek besin altında (NPK) L sadece S (Şekil 1c) biraz daha iyi yetişir Pl daha iyi yetişir. Her üç farklı tedaviler altında yetiştirilen satırlar arasında bir karşılaştırma Şekil 1 d gösterilir f. Pl, kontrol koşulları (Şekil 1d), altında iyi yetişir, yüksek besin (Şekil 1e) ve S altında L iyi benzer yüksek besin ve kontrol koşulları altında (Şekil 1f).
Bu veriler, üç satır üç ortamlarda büyüme göre ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. Not L (indüklenen altında) NPK koşulları altında en iyi yetişir Pl kontrol koşulları altında iyi yetişir. S geliştirilmiş besin koşulları yararlanmak mümkün değildir, ancak çok düşük bir besin koşullar altında büyümek için daha iyi yapabiliyor, her üç koşulları, aynı yetişir.
Bitkilerin farklılaşma ile ilgili büyüme parametreleri (ve her yaprak arasındaki mesafe bu boğum uzunluğu, ile ilişkili), bitki boyu, yaprak boyutu ve dallanma derecesi içerir. Pl kontrol koşulları altında bitki dalları ile uzun boylu ve yaprakları büyük ve koyu yeşil renktedir. Düşük besinleri altında bitki çok kısa, her yaprağı arasındaki mesafe çok kısa ve yaprakları, küçük ve hafif yeşil. Ucunda yaprak, kök aşağı düşürmek daha koyu yeşil. Yüksek besin altında bitki kontrol koşulları altında, ana kök ve yan sürgünler hem kontrol bitkilerin daha kısa olması dışında çok benzer görünüyor. Büyük genotroph için bitkiler yüksek besin altında en güçlü büyüme dışında Pl bu çok benzer. Yine düşük besinleri altındaki bitki çok kısa ve açık yeşil yaprakları vardır. Yaprakları, düşük besin altında hafif yeşil olmasına rağmen S genotroph üç ortamlarda benzer yetişir. Ancak, S genotroph Pl veya L hatları ya da daha düşük besin koşullarında çok daha güçlü.
2. RNA ve DNA ekstraksiyonu, keten meristemlerde ve yaprakları ayrı ayrı yapılır. RNA ekstraksiyonu ve Qiagen DNeasy Bitki DNA hazırlık kiti DNA ekstraksiyon için kullanılan Roche toplam RNA hazırlık kiti kullanıldı.
RNA Ekstraksiyon
- 3 meristemlerde artı bazı çevreleyen yaprak Eppendorf tüp depolama cryovial taşınmış ve zemin olmak için hazır olana kadar sıvı azot içine yerleştirilir.
- Steril kum tüpüne eklenir ve doku ince kadar micropestle kullanılarak öğütülür.
- Roche toplam RNA hazırlık kiti 400 ul lizis / bağlayıcı tamponu eklenir ve doku daha fazla zemin kümeleri görünür olana kadar.
- Örnek için 15 saniye, 1 dakika 13.000 rpm'de kum ve herhangi bir enkaz toplamak için spun sonra lizis yardım ve vortekslenmiş.
- Süpernatant sütun spin eklenir ve yönetmen olarak RNA hazırlık seti talimatlarını geri kalanı takip edilmektedir.
DNAz tedavi
- 10X DNAz tampon 1 / 10 RNA numune hacmi eklenir.
- DNAz, 30 adet ilave edilir ve reaksiyon 37 inkübe ° C de 30 dakika ve 70 ° C 5 dk.
Ters Transkripsiyon
- Her yöne 37 inkübe tepki ° C 1 saat ve 95 ° C'de 5 dakika. Applied Biosystems RNA cDNA kiti olarak kullanılır
CDNA sonra PCR veya qPCR için kullanılır.
qPCR
qPCR ABI Adım Bir sistemi kullanılarak yapıldı. Tüm testlerin her çalışma, üç nüsha olarak yapılmıştır. Aktin gen kopya sayısı kontrolü olarak kullanılmıştırmevcut en iyi temizlik gen.
- Uygun primer çifti 1μl her tüpe eklendi.
- CDNA, uygun konsantrasyonda ve 9μl seyreltilmiş her tüpe eklendi
- 10μl 2x Güç SYBR Green PCR Mastermix (ABI) ve her tüp eklendi
- Program amplifikasyon programı:
- 10 dakika 95 ° C
- 95 15sn 40 döngü ° C, 60 ° C'de 1 dakika
Amplifikasyon özgüllüğü doğrulamak için termal denatürasyon adım - 2 değeri (- CTactin CTunknown) göreceli ifade düzeyleri tespit edildi.
DNA hazırlığı
- Tampon AP1 Qiagen DNeasy Bitki DNA hazırlık kiti bir mikrofuge'de tüp içinde steril kum ile 6 yaprakları eklenir. Kümeleri görülebilir kadar doku micropestle zemin.
- Kit talimatlarını olarak takip edilmektedir.
Sonuçlar
Kök boyunca çeşitli pozisyonlarda yapraklarından izole edilen DNA PCR bitkiler indükleyici koşullar altında (4) büyürken, LIS-1 görünüm oluşur göstermektedir. QPCR sonuçları LIS-1 (veya indüksiyon ile ilişkili diğer genomik değişiklikler) varlığını hemen yakınında LIS-1 (Şekil 2) gen ifadesi etkilediğini göstermektedir. Şekil 2'de gösterildiği gibi altı genler farklı dört yüksek PL ifade (LIS-1 olmadan) ve S daha yüksek ifadesi (LIS-1 var) olan iki sahip Pl ve S olarak ifade edilir. Panel 1 ve 2 LIS-1 ekleme noktasına yakın iki gen vardır. Bu gen ifadesi, farklı büyüme koşulları altında büyük genotroph (indüklenen değişiklikler oldu ama LIS-1 bulunmamış) ve ifade LIS-1 ve ifade değişiklikleri arasında herhangi bir nedensel ilişkiyi belirlemek için gerekli olacaktır.
Şekil 1: Pl, L, S, üç değişik besin rejimler altında büyüdü . Paneller bir kontrolü, b - düşük besin ve c - NPK. d - Pl, e - f - L. Panelleri d - f, soldan sağa: düşük besinler, kontrolü ve NPK. D - Pl, e-L, F - S.
Şekil 2 LIS-1 yerleştirme noktası etrafında. Gen ekspresyonu. Gene 1 (büyüme Inhibitor) LIs1 hemen 5 've LIS-1 gen 2 (Kip-siklin-bağımlı kinaz inhibitörü id 3 "diğer genlerin inşa aynı iskele (~ 500kb) boyunca keten genom dizisi. Lütfen daha büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3 Stormont Cirrus düşük besin koşullar altında yetiştirilen bitkilerin yaprakları ayıklanır DNA'lar PCR. PCR ürünleri% 2'lik agaroz-TBE jel ayrıldı. Uninserted site Paneli gösterilir, eklenen sitenin iki ucu b ve c Panelleri gösterilmiştir Yaprak örnekleri 1 - 6 haftalık aralıklarla örnek 1 ekim sonrası erken izole edildi.
Discussion
Keten doğası gereği istikrarsız bir genom gibi görünüyor. Birkaç nesiller için büyüdüğü zaman ticari lif keten çeşitlerinin sayısı hızla olmayan tekdüze haline. Aynı gözlemler yağ keten çeşitleri için geçerli görünmüyor. Bu nedenle, lif kalitesi ve genom istikrarsızlık seçim arasında bir ilişki varmış gibi görünür. Çevre başlangıçta fiber bitki büyüme agronomik gözlemlerin soruşturma aracılığıyla tespit edilmiştir keten değişiklikler kalıtsal indüklenen. Bu, spesifik fenotipik ve genomik varyasyon tekrarlanabilir gözlemler çevresel stres oluşabilir genomik düzenlenmeleri takımı nasıl etkileyecek sorusunu gündeme getirmektedir. Belirli ortamlara yanıt LIS-1 tekrarlanan bir görünüm, bu mutasyon doğrudan ya da dolaylı olarak seçilen ile tutarlı. Çeşitli tedaviler ile indüklenen hatlarının büyüme de ilgili indükleyici koşullar altında gelişmiş bir performans gösterir. Ifadesi de yine LIS-1 varlığı ile ilişkili değişiklikler bu ekleme bitki performansını etkilediğini göstermektedir. Video sunumu geleneksel basılı malzeme ile iletmek için imkansız bir şekilde bitki fenotipik değişiklikleri gözlemlemek için bir forum sağlar.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
