Summary
بروتوكول للعزل وتفعيل أرومة النطفة من الذكور
Abstract
الذكور والمخنثين هما الاستغلال الجنسي وجدت بشكل طبيعي في الديدان الخيطية جيم ايليجانس. ويتم إنتاج الحيوانات المنوية amoeboid من قبل كل من الذكور والمخنثين. في مرحلة مبكرة من تكون الأعراس ، والخلايا التناسلية من المخنثين تفرق في عدد محدود من الحيوانات المنوية -- حوالي 300 -- ويتم تخزينها في "حقيبة" صغيرة تدعى spermatheca. في وقت لاحق ، المخنثين انتاج البويضات باستمرار 1. في المقابل ، من الذكور حصرا إنتاج الحيوانات المنوية طوال مرحلة البلوغ. انتاج الحيوانات المنوية من الذكور بكثير بحيث تمثل 50 ٪> من مجموع خلايا في البالغين 2 دودة نموذجي. لذلك ، عزل الحيوانات المنوية من الذكور هو أسهل من ذلك من المخنثين من.
تتولد بشكل طبيعي إلا نسبة صغيرة من الذكور بسبب انفصال غير عفوية من كروموسوم X 3. معبر المخنثين مع الذكور أو أكثر سهولة ، وإدخال طفرات تثير له (نسبة عالية من الذكور) النمط الظاهري هي بعض الاستراتيجيات التي من خلالها يمكن للمرء أن تثري السكان الذكور 3.
ويمكن تمييزها بسهولة من الذكور المخنثين من خلال ملاحظة 4 مورفولوجيا الذيل. وأشار خنثى الذيل ، في حين أن يتم تقريب الذيل مع هياكل الذكور التزاوج.
قطع الذيل النشرات عدد كبير من أرومة النطفة المخزنة داخل الجهاز التناسلي للذكور. يتم إجراء تشريح تحت المجهر ستيريو باستخدام الإبر قياس 27. منذ ليست مرتبطة ماديا أرومة النطفة مع أي الخلايا الأخرى ، والضغط الهيدروليكي يطرد المحتويات الداخلية للجسم الذكر ، بما في ذلك أرومة النطفة 2.
يتم تشريح الذكور مباشرة على قطرة صغيرة من "متوسطة الحيوانات المنوية. أرومة النطفة حساسة للتغيير في درجة الحموضة. وبالتالي ، يتم استخدام HEPES ، وهو مركب مع قدرة التخزين المؤقت جيدة في وسائل الإعلام الحيوانات المنوية. الجلوكوز والأملاح الأخرى الموجودة في الحيوانات المنوية وسائل الاعلام المساعدة في الحفاظ على الضغط الاسموزي للحفاظ على سلامة الحيوانات المنوية.
ويطلق على مرحلة ما بعد الانتصافي تمايز أرومة النطفة المنوية في السائل المنوي تكون النطاف أو التنشيط. يهز 5 ، 6 ونيلسون وأظهرت في وقت سابق ان يمكن أن يتسبب أرومة النطفة في جولة على التمايز إلى الحيوانات المنوية وذلك بإضافة مركبات مختلفة بما في ذلك تفعيل E. Pronase هنا نظهر تكون النطاف في المختبر من C. أرومة النطفة ايليجانس باستخدام Pronase E.
تكون النطاف الناجح هو الشرط المسبق للخصوبة وبالتالي تكون النطاف في المسوخ المعيبة هي عقيمة. وقد أظهرت العديد من المسوخ حتى الآن ليكون معيبا على وجه التحديد في عملية تكون النطاف 7. وجدت خلال شذوذ في تفعيل المختبر من جمعية مهندسي البترول رواية (الحيوانات المنوية المعيبة) المسوخ من شأنه أن يساعدنا اكتشاف اللاعبين إضافية المشاركة في هذا الحدث.
Protocol
1) إثراء السكان الذكور
- اعتمادا على الحاجة تجريبية ، يمكن الحصول على أعداد كبيرة من الذكور من خلال توظيف واحدة من الاستراتيجيات التالية :
- ويمكن الحصول على عدد كبير من السكان من الذكور نوع البرية عن طريق عبور 5 ذكور نوع البرية وخنثى 1 على الحديقة الصغيرة OP50 المصنف في المركز من لوحة NGM. وتقريبا 50 ٪ من الذكور يكون خلفا لتوليد نوع البرية.
- له - 5 (e1490) أو له 8 (e1489) المخنثين رمي عدد كبير من الذكور. له - 5 - 8 وعليه الذكور الخصبة ، وليس هناك عيب واضح في التشكل الحيوانات المنوية وظيفة. بذلك ، له أو عليه - 5 - 8 يمكن استخدامها بدلا من الذكور الذكور النوع البري للتجارب كثيرة.
2) تحديد وعزل الذكور
- دراسة مورفولوجية ذيل الديدان ؛ يتم تقريب ذيل الدودة الذكر.
- اختيار الذكور المرحلة L4 ونقلها إلى لوحة المصنف NGM مع هاء OP50 القولونية وتركها لتنمو لمدة يوم أو اثنين. تزايد الذكور عازب في غياب المخنثين منع فقدان الحيوانات المنوية ، وبالتالي عدد كبير من أرومة النطفة ستكون متاحة خلال إجراء التجارب.
- يوم تشريح ، ونقل الذكور عازب إلى لوحة NGM دون البكتيريا والسماح لهم الزحف لبضع دقائق. هذه الخطوة تساعد على إزالة طبقة صغيرة من E. انضمت القولونية على سطح من الديدان. بدلا من ذلك ، ماصة صغر حجم العازلة M9 (6G نا 2 4 هبو ، 3G KH 2 PO 4 ، 5G كلوريد الصوديوم ، 0.25g MgSO 4 H 2 O 0.7 لتر) في زجاج الساعات ونقل الذكور في المخزن المؤقت.
3) من الذكور و التشريح في المختبر التنشيط
- تأخذ شريحة زجاجية وعلامة دائرة صغيرة باستخدام قلم حلمة الثدي. ماصة 30-50 ميكرولتر من الحيوانات المنوية متوسطة 1X (HEPES 50mM ، 25mM بوكل ، 45mM كلوريد الصوديوم ، 1MM MgSO 4 ، CaCl 5mM 2 ، 10MM سكر العنب ؛ الرقم الهيدروجيني 7.8) داخل الدائرة. دائرة مسعور يساعد على الاحتفاظ المتوسطة الحيوانات المنوية داخل حدودها.
- نقل الذكور 5-10 إلى المتوسطة الحيوانات المنوية.
- عرض الشرائح تحت المجهر ، وعقد اجتماعين مع إبر المحاقن المرفقة قياس 27 على كل من يديك.
- استخدم أحد إبرة إلى "الانتظار" ودودة واستخدام إبر أخرى لخفض نهاية الخلفي من الذكور للافراج عن أرومة النطفة.
- قطع الدودة يطرد عادة عدد كبير من أرومة النطفة في التو واللحظة. وأرومة النطفة مرئية ودقيقة "حبيبات" تحت المجهر ستيريو. ومع ذلك ، قد تكون في بعض الأحيان الاحتفاظ جزء أو أكثر من أرومة النطفة داخل الجثة. في هذه الحالة ، قد بلطف "سحب" الذبيحة على شريحة زجاجية تسهيل الإفراج عن أرومة النطفة من الجثة.
- لتنشيط أرومة النطفة ، تشريح الديدان في متوسطة تحتوي على الحيوانات المنوية 1X E Pronase (20μg/ml) والسماح لهم الجلوس لمدة 5 دقائق.
- لا تسمح الشرائح لتصبح جافة في أي نقطة زمنية التجربة. إضافة المزيد من 1X متوسطة الحيوانات المنوية إذا لزم الأمر.
4) من التصور spermtids والحيوانات المنوية
- المكان بلطف ساترة على سطح عينة تشريح.
- العثور على حقل من أرومة النطفة تحت التكبير المنخفض (10X)
- ويمكن ملاحظة التفاصيل الدقيقة من أرومة النطفة أو الحيوانات المنوية التي تتحرك إلى أعلى التكبير -- عادة في الغمر النفط 100X.
5) الممثل النتائج
ويرد مثال لصورة مدينة دبي للإنترنت من أرومة النطفة معزولة عن ايليجانس جيم الذكور في الشكل 1. أرومة النطفة هي كروية الشكل ونواة بارزة في تنشيط الحيوانات المنوية والمختبر هو مبين في الشكل 2.
الشكل 1. صورة من مدينة دبي للإنترنت C. أرومة النطفة ايليجانس.
الشكل 2. صورة من مدينة دبي للإنترنت في المختبر تنشيط C. ايليجانس الحيوانات المنوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بالإضافة إلى تحليل المسوخ جمعية مهندسي البترول ، وهذا البروتوكول لها تطبيقات هامة أخرى ، مثل تحليل مورفولوجيا الحيوانات المنوية مع الشيخوخة. ويمكن استخدام الحيوانات المنوية وأرومة النطفة معزولة باستخدام هذا البروتوكول في التجارب النهائية الاخرى مثل immunostaining من نوع البرية والحيوانات المنوية متحولة 8 ، 9 ، حركية الحيوانات المنوية على شرائح 10 ، والقياسات الفسيولوجية 9 ، 11 ، أو التلقيح الاصطناعي حتى 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر صموئيل وارد ، وتهز ديان جيم نيلسون غريغوري لهذه التقنية الرائدة. نشكر بافان Kadandale Geldziler وبريان لتنشيط الحيوانات المنوية فيديو يظهر فيها واعضاء مختبر لاجراء مناقشات مفيدة سينجسون ؛ لسلالات والمعاهد الوطنية للصحة CGC لدعم لنا من خلال منح (R01HD054681).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. , Vol. 48 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
