Summary
अलग और पुरुष से spermatids सक्रिय करने के लिए एक प्रोटोकॉल
Protocol
1) पुरुष जनसंख्या का संवर्धन
- प्रयोगात्मक की आवश्यकता पर निर्भर करता है, पुरुषों की बड़ी संख्या निम्नलिखित रणनीतियों के द्वारा रोजगार प्राप्त किया जा सकता है:
- जंगली प्रकार पुरुषों की बड़ी आबादी OP50 वरीयता प्राप्त एन जी एम प्लेट के केंद्र में एक छोटे लॉन पर 5 जंगली प्रकार पुरुषों और 1 उभयलिंगी पार करके प्राप्त किया जा सकता है. मोटे तौर पर सफल पीढ़ी के 50% जंगली प्रकार पुरुषों जाएगा.
- (e1490) उसे 5 या उससे-8 (e1489) hermaphrodites पुरुषों की बड़ी संख्या में फेंक उसे पाँच और उसे 8 पुरुषों उपजाऊ रहे हैं और वहाँ शुक्राणु morphology और समारोह में कोई स्पष्ट दोष है . तो, उसे 5 या उससे-8 पुरुषों के कई प्रयोगों के लिए जंगली प्रकार के पुरुषों के एवज में इस्तेमाल किया जा सकता है.
2) और पुरुषों की पहचान अलगाव
- जांच कीड़े की पूंछ आकारिकी, पुरुष कीड़ा पूंछ गोल है.
- L4 मंच पुरुषों उठाओ और उन्हें ई. के साथ एक एन जी एम थाली वरीयता प्राप्त करने के लिए स्थानांतरण कोलाई OP50 और उन्हें एक या दो दिन के लिए विकसित . Hermaphrodites के अभाव में बढ़ते ब्रह्मचारी पुरुषों के शुक्राणु की हानि को रोकने और इस प्रकार spermatids की प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान बड़ी संख्या में उपलब्ध हो जाएगा.
- विच्छेदन के दिन, जीवाणु के बिना एक एन जी एम थाली पर ब्रह्मचारी पुरुषों हस्तांतरण और उन्हें कुछ मिनट के लिए क्रॉल. इस कदम के लिए ई. के छोटे से परत को हटाने में मदद करता है कीड़े की सतह पर पालन कोलाई. वैकल्पिक रूप से, पिपेट एक घड़ी बफर में कांच और हस्तांतरण पुरुषों में M9 बफर (6g ना 2 HPO 4, 3 जी 2 के.एच. पीओ 4, 5g NaCl, 0.25g MgSO 4 0.7 एच 2 हे प्रति लीटर) की छोटी मात्रा .
3) पुरुषों और इन विट्रो सक्रियण में विच्छेदन
- एक गिलास स्लाइड ले लो और एक छोटा सा एक पैप पेन का उपयोग वृत्त निशान. पिपेट 1X शुक्राणु मध्यम के 30-50 (HEPES 50mm, 25mm KCl, 45mm NaCl, 1mm MgSO 4, 5mm 2 CaCl, 10mm Dextrose, पीएच 7.8) μl सर्कल के भीतर. हाइड्रोफोबिक चक्र को अपनी सीमा के भीतर शुक्राणु माध्यम बनाए रखने में मदद करता है.
- शुक्राणु मध्यम पर 5-10 पुरुषों स्थानांतरण.
- माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड देखना, दो अपने हाथों के दोनों पर 27 गेज सुई के साथ संलग्न सीरिंज पकड़.
- कीड़ा 'पकड़' और अन्य सुई का उपयोग करने के लिए पुरुषों के पीछे के अंत में कटौती के लिए spermatids रिहाई एक सुई का प्रयोग करें.
- कीड़ा काटना आमतौर पर spermatids की विशाल संख्या तत्क्षण expels. spermatids स्टीरियो माइक्रोस्कोप के अंतर्गत 'granules मिनट के रूप में दिखाई दे रहे हैं. लेकिन, कभी कभी हिस्सा है या spermatids के सबसे लोथ के भीतर बनाए रखा हो सकता है. उस मामले में, धीरे से गिलास स्लाइड पर लोथ 'खींच' लोथ से spermatids की रिहाई की सुविधा हो सकती है.
- Spermatids सक्रिय करने के लिए, 1X शुक्राणु मध्यम में कीड़े Pronase ई (20μg/ml) युक्त काटना और उन्हें 5 मिनट के लिए बैठते हैं.
- स्लाइड्स के प्रयोग के किसी भी समय बिंदु पर सूखी बनने के लिए अनुमति न दें. अगर जरूरत अधिक 1X शुक्राणु मध्यम जोड़ें.
4) spermtids और शुक्राणु का विज़ुअलाइज़ेशन
- धीरे dissected नमूना की सतह पर एक coverslip जगह.
- कम बढ़ाई (10X) के तहत spermatids के क्षेत्र का पता लगाएं
- 100X तेल विसर्जन पर आम तौर पर - spermatids या शुक्राणु का ठीक विवरण उच्च बढ़ाई जाने से मनाया जा सकता है.
5) प्रतिनिधि परिणाम
पुरुष सी एलिगेंस से अलग spermatids डीआईसी छवि का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है. Spermatids आकार में गोलाकार होते हैं और नाभिक प्रमुख हैं इन विट्रो सक्रिय शुक्राणु में चित्रा 2 में दिखाया जाता है ..
चित्रा 1 सी. के डीआईसी छवि. एलिगेंस spermatids.
चित्रा 2 इन विट्रो सक्रिय सी. में डीआईसी छवि. एलिगेंस शुक्राणु.
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Discussion
विशेष म्यूटेंट का विश्लेषण करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल अन्य महत्वपूर्ण अनुप्रयोगों, जैसे उम्र बढ़ने के साथ शुक्राणु morphology का विश्लेषण है. Spermatids और अलग शुक्राणु इस प्रोटोकॉल का उपयोग जैसे अन्य बहाव के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती शुक्राणु 8, 9, 10 स्लाइड्स, शारीरिक माप 9, 11, या भी कृत्रिम गर्भाधान 12 पर शुक्राणु की गतिशीलता की immunostaining.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
Diane सी., हम शमूएल वार्ड धन्यवाद हिलाता है और इस तकनीक में अग्रणी करने के लिए ग्रेगरी नेल्सन. हम सक्रिय शुक्राणु दिखा वीडियो के लिए धन्यवाद पवन Kadandale और ब्रायन Geldziler, Singson उपयोगी विचार - विमर्श के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों, CGC उपभेदों और NIH के लिए अनुदान (R01HD054681) के माध्यम से हमें समर्थन करने के लिए.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
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