Summary
남성에서 spermatids을 분리하고 활성화하기위한 프로토콜
Abstract
남성과 나온것은 선충류 C. 엘레간스에있는 두 자연스럽게 발견 성적 양식입니다. amoeboid 정자는 남성과 나온것 모두에 의해 생성됩니다. 300 - - gametogenesis의 이전 단계에서 나온것의 배아 세포는 정자의 제한 번호로 차별과 spermatheca라는 작은 '가방'에 저장됩니다. 나중에, 지속 oocytes 1 생산 나온것. 반면, 남성들은 성인에 걸쳐 독점적으로 정자 생산하고 있습니다. 남성은 전형적인 성인 웜 2 전체 세포의> 50 %를 차지하고 그 많은 정자를 생산하고 있습니다. 따라서 남성의 정자를 분리하는 것은 나온것의에서보다 쉽습니다.
남성의 극소수는 자연의 X 염색체 3 자연 이외의 분리로 인해 생성됩니다. 보다 편리하게 남성 또는 그에게 상승을주는 돌연변이의 소개 (수컷의 높은 발병률) 표현형로 나온것 크로싱하면 그 중 하나가 남성 인구 3 풍부 수있는을 통해 전략의 일부입니다.
남성은 쉽게 꼬리 형태 4을 관찰하여 나온것 구별하실 수 있습니다. 남성 꼬리가 짝짓기 구조 둥근 반면 남녀 추니 꼬리는 지적이다.
꼬리를 잘랐다 남성의 생식 요로 내에 저장된 spermatids의 수많은 출시. 해부가 27 게이지 바늘을 사용하여 스테레오 현미경으로 수행됩니다. spermatids가 실제로 다른 세포와 연결되지 않은 상태 때문에, 유압 압력 spermatids이 남성을 포함한 신체의 내부 내용을 퇴학.
말스 직접 '정자 보통'의 작은 방울을 해부하고 있습니다. Spermatids는 산도의 변경에 민감합니다. 따라서 HEPES, 좋은 버퍼링 용량을 가진 화합물은 정자 미디어에서 사용됩니다. 포도당과 정자 매체에있는 다른 소금은 정자의 무결성을 유지하기 위해 삼투압을 유지할 수 있도록 도와주십시오.
마리의 정자 수야에 spermatids의 포스트 meiotic 분화는 spermiogenesis 또는 정자의 정품 인증을 칭했다있다. 5 쉐익스하고, 넬슨 6 이전 라운드 spermatids 여기서 우리는 C.의 체외 spermiogenesis에서 보여주는 Pronase E. 등 다양한 활성화 화합물을 추가하여 마리의 정자 수야으로 차별화할 수있는 유도했다 Pronase E.을 사용 엘레간스의 spermatids
성공 spermiogenesis 임신을위한 필수 조건이며 따라서 spermiogenesis에 결함이 돌연변이 멸균됩니다. 지금까지 여러 가지 돌연변이가 특별히 spermiogenesis 과정 7 결함이 표시되었습니다. 이상은 소설 Spe (Spermatogenesis 결함)의 체외 활성화에 돌연변이 우리가이 행사에 참여 추가 선수를 발견할 도움이 될 중에 발견했습니다.
Protocol
남성 인구의 1) 농축
- 실험 필요에 따라 남성의 큰 숫자는 다음 전략 중 하나를 채용하여 구할 수 있습니다 :
- 야생 타입 남성의 큰 인구는 NGM 판의 중앙에 OP50 씨앗의 작은 잔디 5 야생 타입 남성 1 남녀 추니를 건너하여 얻을 수 있습니다. 성공 세대의 약 50 %가 야생 타입 남성 것입니다.
- 그를 - 5 (e1490) 또는 그를 - 8 (e1489) 나온것 그를 - 5. 남성의 큰 숫자를 던져 그를 - 8 남성 비옥하고 정자의 형태와 기능에 명백한 결함이 없습니다. 그래서, 그를 - 5 또는 그와는 - 8 남성은 많은 실험을위한 야생 타입 남성 대신에 사용할 수 있습니다.
남성 2) 식별 및 격리
- 벌레의 꼬리 형태를 검사하고, 남성 웜 꼬리가 반올림됩니다.
- L4 무대 남성을 선택하고 E. 가진 NGM 접시 씨앗에게 전송 대장균은 그들이 하루나 이틀 성장 OP50 및하자. 나온것의 부재로 성장 독신 남성은 정자의 손실을 방지하고 따라서 spermatids의 많은 수의 실험 절차를 수행하는 동안 사용 가능한 것입니다.
- 해부의 날, 세균없이 NGM 접시에 독신 남성을 전송하고 그들이 몇 분 동안 크롤 링을 보자. 이 단계는 E. 작은 레이어를 제거하는 데 도움이됩니다 대장균은 벌레의 표면에 준수. 또는 버퍼로 시계 유리 및 전송 남성의 M9 버퍼 (6g 나 2 HPO 4, KH 2 PO 3g 4 5g NaCl, 0.25g MgSO 리터 당 4 0.7 H 2 O)의 피펫 소량.
남성과 체외 활성화 3) 해부
- 유리 슬라이드를 타고 자궁 펜을 사용하여 작은 원을 표시합니다. 피펫 1X 정자 매체 30-50 μl (50mM HEPES, 25mM KCl, 45mM NaCl, 1mM MgSO 4, 5mM CaCl 2, 10mM 덱스 트로 오스, 산도 7.8) 원 안에. 소수성 원은 그 경계 내에서 정자 매체를 유지하는 데 도움이됩니다.
- 정자 매체에 50-10 수컷을 전송합니다.
- 현미경 슬라이드를보기, 당신 손 모두에서 27 게이지 바늘로 연결된 두 주사기를 개최.
- 벌레를 '대기'와 spermatids를 공개 남성의 뒷부분 끝을 잘라 다른 바늘을 사용하여 하나의 바늘을 사용합니다.
- 벌레를 절단하는 것은 대개 즉시 spermatids의 수많은 퇴학. spermatids는 분 스테레오 현미경 '과립'로 볼 수 있습니다. 그러나, 때로는 일부 또는 spermatids의 대부분은 시체 내에 남아있을 수 있습니다. 이 경우에는 조심스럽게 유리 슬라이드 위에 시체 '를 드래그하면'시체에서 spermatids의 출시를 용이하게 수 있습니다.
- spermatids를 활성화하려면, Pronase 전자 (20μg/ml)를 포함하는 1X 정자 중간에 벌레를 해부하다하고 5 분 동안 앉아 보자.
- 슬라이드 실험의 시점에서 건조되는 것을 허용하지 않습니다. 필요한 경우 더 많은 1X 정자 매체를 추가합니다.
spermtids와 마리의 정자 수야 4) 시각화
- 부드럽게 해부 표본의 표면에 coverslip을 넣으십시오.
- 낮은 배율 (10X)에서 spermatids 분야 찾기
- 보통 100X 기름 침지에서 - spermatids 또는 마리의 정자 수야의 세밀한 부분이 더 높은 배율로 이동하여 볼 수 있습니다.
5) 대표 결과
남성 C. 엘레간스으로부터 격리 spermatids의 DIC 이미지의 예제는 그림 1에 표시됩니다. Spermatids는 형태 구형이며 핵은 유수 있습니다. 체외 활성화의 정자에서는 그림 2에 표시됩니다.
그림 1. C.의 DIC 이미지 엘레간스의 spermatids.
그림 2. 체외 활성화 C로의 DIC 이미지 엘레간스은 마리의 정자 수야.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spe 돌연변을 분석뿐만 아니라,이 프로토콜은 노화와 정자의 형태를 분석과 같은 다른 중요한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 이 프로토콜을 사용 Spermatids과 격리 마리의 정자 수야는 야생 타입과 돌연변이 정자 8, 9, 슬라이드 10, 생리적 측정 9, 11, 또는 인공 수정 12 정자의 운동성의 immunostaining 같은 다른 스트림 실험에서 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 사무엘 구청 감사, 다이앤 C.이 기술을 개척을위한 쉐익스과 그레고리 넬슨. 우리는 활성 마리의 정자 수야을 보여주는 동영상을위한 파반 Kadandale와 브라이언 Geldziler 감사, 도움이 토론에 대한 Singson 연구실의 구성원, CGC 종자와 NIH에 대한 권한을 부여 (R01HD054681)를 통해 우리를 지원하십시오.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. , Vol. 48 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
