Summary
Протокол выделения и активации сперматиды от мужских
Protocol
1) Обогащение мужского населения
- В зависимости от экспериментальной необходимо большое число мужчин может быть получена путем использования одного из следующих стратегий:
- большой популяции диких мужчин типа может быть получен путем скрещивания дикой 5 мужчин и 1 типа гермафродит на небольшой лужайке OP50 посеян в центре пластины NGM. Примерно 50% последующее поколение будет диких мужчин типа.
- его-5 (e1490), либо его-8 (e1489) гермафродиты выбросить большое количество мужчин. ним-5 и его-8 самцов плодородная и нет очевидных дефектов в морфологии сперматозоидов и функции. Таким образом, ему-5 или ему-8 самцов можно использовать вместо дикого мужчины типа для многих экспериментах.
2) выявление и изоляция мужчин
- Изучить хвост морфологии червей, хвост мужчина червя округляется.
- Выберите L4 мужчин сцене и передавать их на пластины NGM отобранный с Е. кишечной OP50, и пусть они растут в течение дня или двух. Рост безбрачия мужчин в отсутствие гермафродитов предотвратить потерю спермы и, таким образом большое количество сперматиды будут доступны во время эксперимента.
- В день вскрытия, передача безбрачия мужчин на NGM пластины без бактерий и позволить им ползать в течение нескольких минут. Этот шаг помогает снять небольшой слой E. кишечной придерживался на поверхность червей. Кроме того, пипетки небольшой объем буфера M9 (6 г Na 2 HPO 4, 3 г KH 2 PO 4, 5 г NaCl, 0,25 г MgSO 4 .7 H 2 O на литр) в часовое стекло и передача мужчин в буфер.
3) Препарирование мужчин и в активации пробирке
- Возьмите предметное стекло и отметьте небольшой круг, используя пап пера. Внесите 30-50 мкл 1X Средний сперматозоидов (50 мМ HEPES, 25 мМ KCl, 45 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4, 5 мМ CaCl 2, 10 мМ глюкозы, рН 7,8) в пределах круга. Гидрофобные круг помогает сохранить сперму среду в пределах его границ.
- Передача 5-10 мужчин на сперму среды.
- Просмотр слайдов под микроскопом, удерживая два шприца с приложением 27 иглы на обеих руках.
- Используйте одну иглу 'держать' червя и использовать другие иглы, чтобы сократить заднем конце мужчин выпустить сперматиды.
- Резка червь обычно изгоняет огромного количества сперматид мгновенно. Сперматиды видны как минуту "гранулы" под стерео микроскопом. Однако, иногда часть или большинство сперматиды могут быть сохранены в туши. В этом случае, мягко "перетаскивания" туша за стекло может способствовать освобождению сперматиды от туши.
- Для активации сперматид, рассекать червей в 1X Средний спермы содержащие проназы Е (20μg/ml), и пусть они сидят в течение 5 минут.
- Не позволяйте слайды становятся сухими в любой момент времени эксперимента. Добавить еще 1X спермы среднего, если необходимо.
4) Визуализация spermtids и сперматозоиды
- Аккуратно покровное на поверхности расчлененный образца.
- Найти области сперматиды при малом увеличении (10х)
- Мелкие детали сперматиды или сперматозоиды можно наблюдать при переходе на большем увеличении - как правило, на 100X иммерсионного масла.
5) представитель Результаты
Примером DIC образ сперматиды изолированы от мужчин C. Элеганс показано на рисунке 1. Сперматиды имеют сферическую форму и ядер занимают видное место. В пробирке сперматозоиды активированный показаны на рисунке 2.
Рисунок 1. DIC образ C. Элеганс сперматиды.
Рисунок 2. DIC изображение в пробирке активированный C. Элеганс сперматозоидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В дополнение к анализу Spe мутантов, этот протокол имеет и другие важные приложения, такие как анализ морфологии сперматозоидов со старением. Сперматиды и сперматозоиды выделяют, используя этот протокол можно использовать в других экспериментах вниз по течению, таких как, иммунной дикого типа и мутантных спермы 8, 9, подвижность сперматозоидов на слайдах 10, физиологических измерений 9, 11, или даже искусственное оплодотворение 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Сэмюэл Уорд, Диана С. Вибрация и Грегори Нельсона за пионерский этой техники. Мы благодарим Pavan Kadandale и Брайан Geldziler для видеозаписи активированный сперматозоидов, члены лаборатории Singson за полезные обсуждения, CGC для штаммов и NIH за поддержку посредством гранта (R01HD054681).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. , Vol. 48 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
