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Biology

分离和激活线虫精子

Published: January 31, 2011 doi: 10.3791/2336

Summary

一个来自男性的精子细胞的分离和激活的协议

Abstract

男性和雌雄同体自然就找到了两种线虫线虫性形式。变形虫精子产生的男性和雌雄同体。在配子发生的早期阶段,雌雄同体的生殖细胞分化成精子数量有限 - 约300 - ,并存储在一个小的“袋”之称的精囊。后来,雌雄同体不断产生卵母细胞 1。相比之下,男性产生专其整个成年的精子。男性产生这么多的精子,它在一个典型的成虫 2细胞总数的50%帐户。因此,隔离来自男性的精子是较雌雄同体容易。

只有一小部分男性是自然产生自发的非分离的X 染色体 3 。隧道与男性或更方便,引入的突变引起他(男性的高发病率)表型的雌雄同体的一些战略,通过它可以丰富男性人口3。

男性可以很容易地区别于雌雄同体通过观察尾部形态4。指出,雌雄同体的尾巴,而雄性的尾巴是交配结构的圆形。

切割尾部释放广大男性生殖道内储存的精子。夹层使用27表针的立体显微镜下进行。由于精子是不是身体与任何其他细胞相连,液压排出内部的内容包括男性身体精子 2 。

男性有直接解剖上的“精子中等”的小降。精子细胞是敏感的pH值的改变。因此,HEPES,一种化合物具有良好的缓冲能力是精子媒体使用。葡萄糖和其他盐类存在于精子媒体帮助维持渗透压,保持精子的完整性。

被称为减数分裂后的精子细胞分化成精子的精子或精子激活。震撼5,6尼尔森先前表明,圆形精子细胞能够被诱导分化成精子,通过添加各种活性化合物,包括链霉蛋白酶大肠杆菌在这里, 我们证明体外精子的C 线虫精子使用链霉蛋白酶E。

成功的精子是生育的先决条件,因此,在精子缺陷的突变体是无菌的。迄今几个突变体已被证明特别是在有缺陷的精子形成过程7。异常时,发现在体外激活新型SPE(有缺陷的精子)的突变体,将有助于我们发现参与此事件的其他球员。

Protocol

1)男性人口的富集

  1. 根据实验的需要,大量的男性可以得到采用以下策略之一:
    1. 人口众多的野生型男性可OP50种子NGM板中心的一个小草坪上穿过5野生型男性和1雌雄同体。大约50%的后代子孙将野生型的男性。
    2. 他5(e1490)他- 8(e1489)雌雄同体抛出大量的男性他的8男性肥沃的精子的形态和功能没有明显的缺陷。因此, 他的男性8例,代替野生型的男性,许多实验使用。

2)识别和隔离的男性

  1. 检查尾部形态的蠕虫,雄性蠕虫的尾巴是四舍五入。
  2. 选择L4阶段的男性,他们转移到与E. NGM板种子大肠杆菌 OP50和让他们成长为一两天。雌雄同体的情况下成长独身者在男性防止精子的损失,因此大量的精子会在实验过程中。
  3. 在一天的清扫,无细菌转移到NGM板独身的男性,并让他们爬几分钟。这一步,有助于消除 E.小层坚持对大肠杆菌的蠕虫病毒表面。另外,吸管M9的缓冲区(6克娜2 HPO 4,3G KH 2 PO 4,5G氯化钠,0.25克硫酸镁4 .7 H 2 O每公升)体积小,在手表玻璃和转移到缓冲区的男性。

3)夹层的男性和体外活化

  1. 载玻片和使用PAP笔标记一个小圆圈。吸取30-50μL精子中等1X(HEPES 50MM,25MM氯化钾,氯化钠45MM, 硫酸镁 1MM 5MM,10MM 氯化钙葡萄糖,pH值7.8)的圆圈内。疏水性循环,有助于保持在其边界内的精子中等。
  2. 5-10男性精子介质传输。
  3. 在显微镜下观看的幻灯片,按住两个注射器连接你的手都与27表针。
  4. 使用一根针“持有”的蠕虫和使用其他的针切男性结束后释放精子。
  5. 切割的蠕虫病毒,通常排出的精子大量瞬间。精子是分钟“颗粒”的立体显微镜下可见。但是,有时部分或大部分的精子可能会保留在胴体。在这种情况下,轻轻地“拖”的载玻片上的胴体,可能有助于释放精子的胴体。
  6. 要激活的精子细胞,解剖1X精子中等含链霉蛋白酶E(20μg/ml)的蠕虫,并让他们坐了5分钟。
  7. 不要让幻灯片成为干在任何时间点的实验。如果需要添加更多的1X精子中等。

4)可视化spermtids和精子

  1. 解剖样品表面轻轻放在盖玻片。
  2. 查找领域的精子在低倍率(10X)
  3. 迁移到更高的放大倍率 - 100X油浸通常可以观察到精子或精子的精细细节。

5)代表性的成果

DIC的男性线虫分离出精子形象的一个例子是如图1所示。精子细胞是球形的细胞核突出,在体外激活精子,如图2所示。

图1
图1 C. DIC的形象 线虫精子细胞。

图2
图2 在体外激活C. DIC的形象 线虫精子。

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Discussion

除了分析SPE突变体,该协议有其他重要的应用,如精子形态分析与衰老。使用此协议的精子细胞和精子分离出可用于在其他下游实验,如野生型和突变体的精子8,9,幻灯片10, 生理测量9,11,甚至人工授精12精子活力的免疫。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们感谢,黛安C.塞缪尔沃德奶昔和格雷戈里纳尔逊这种技术的先驱。我们感谢帕Kadandale和布赖恩Geldziler视频显示激活精子,有益的讨论Singson实验室成员;株和美国国立卫生研究院的总部大楼为我们支持通过授予(R01HD054681)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tuberculin syringe BD Biosciences 309623 Syringe: 1 ml, needle:
27G X ½ in
Pap pen Zymed Laboratories, Inc. 00-8888
VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides VWR international 16004-406 Dimension:
75X25X1mm
Cover glass VWR international 48366045
Protease Sigma-Aldrich P-6911

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References

  1. Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
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  3. Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
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Tags

发育生物学,第47期,精子细胞,精子,精子,蛋白酶,伪足,线虫
分离和<em在体外</em>激活<em>线虫</em>精子
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Cite this Article

Singaravelu, G., Chatterjee, I.,More

Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).

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