Summary
Um protocolo para isolar e ativando espermátides de macho
Abstract
Machos e hermafroditas são as duas formas encontradas naturalmente sexual na nemátodo C. elegans. Os espermatozóides amebóides são produzidos por machos e hermafroditas. Na fase anterior do gametogênese, as células germinativas dos hermafroditas diferenciar em número limitado de espermatozóides - cerca de 300 - e são armazenados em um "saco" pequena chamada espermateca. Mais tarde, os hermafroditas produzem continuamente oócitos 1. Em contraste, os homens produzem espermatozóides durante toda a sua exclusiva idade adulta. Os machos produzem espermatozóides tanto que representa> 50% do total de células em um 2 adulto típico worm. Portanto, isolar os espermatozóides dos machos é mais fácil do que da de hermafroditas.
Apenas uma pequena proporção dos machos são naturalmente gerados devido à espontânea de não-disjunção do cromossomo X 3. Cruzamento com os machos hermafroditas ou mais convenientemente, a introdução de mutações a dar origem a Ele (alta incidência de machos) fenótipo são algumas das estratégias através das quais pode-se enriquecer a população masculina 3.
Os machos podem ser facilmente distinguidos dos hermafroditas, observando os 4 morfologia da cauda. Cauda hermafrodita é apontado, ao passo que no sexo masculino é de cauda arredondada com estruturas de acasalamento.
Corte a cauda libera grande número de espermátides armazenada dentro do trato reprodutivo masculino. Dissecção é realizada sob um microscópio estéreo com 27 agulhas. Desde espermátides não estão fisicamente conectados com quaisquer outras células, a pressão hidráulica expele o conteúdo interno do corpo masculino, incluindo espermátides 2.
Os machos são diretamente dissecado em uma pequena gota de 'Medium esperma'. Espermátides são sensíveis a alteração no pH. Assim, HEPES, um composto com boa capacidade de tamponamento é utilizada nos meios de comunicação de esperma. Glicose e outros sais presentes na mídia esperma ajudar a manter a pressão osmótica para manter a integridade dos espermatozóides.
Pós-meiótica diferenciação de espermátides em espermatozóides é denominado espermiogênese ou ativação de esperma. Shakes 5, 6 e Nelson anteriormente mostrou que espermátides arredondadas podem ser induzidas a se diferenciarem em espermatozóides pela adição de compostos de ativar diversos, incluindo pronase E. Aqui demonstramos in vitro espermiogênese de C. espermátides elegans utilizando pronase E.
Espermiogênese de sucesso é pré-requisito para a fertilidade e, portanto, os mutantes defeituosos em espermiogênese são estéreis. Até então vários mutantes foram mostrados para ser defeituoso, especificamente no processo de espermiogênese 7. Anormalidade encontrada durante a ativação in vitro de romance Spe (Espermatogênese defeituoso) mutantes iria nos ajudar a descobrir jogadores adicionais participar neste evento.
Protocol
1) O enriquecimento da população masculina
- Dependendo da necessidade experimental, um grande número de homens pode ser obtida através do emprego de uma das seguintes estratégias:
- grande população de machos do tipo selvagem pode ser obtida através do cruzamento 5 machos tipo selvagem e um hermafrodita em um gramado pequeno de OP50 semeado no centro da placa NGM. Cerca de 50% da geração seguinte será do sexo masculino do tipo selvagem.
- ele-5 (e1490) ou ele-8 (e1489) hermafroditas jogar grande número de machos.-lo-5-8 e ele os machos são férteis e não há nenhum defeito óbvio na morfologia espermática e função. Então, ele-5 ou ele-8 do sexo masculino pode ser usado no lugar de homens do tipo selvagem de muitos experimentos.
2) Identificação e isolamento dos machos
- Examinar a morfologia da cauda de vermes; cauda do verme macho é arredondada.
- Escolha L4 machos palco e transferi-los para uma placa NGM semeado com E. coli OP50 e deixá-los crescer para um dia ou dois. Crescente homens celibatários na ausência de hermafroditas evitar a perda de esperma e, assim, grande número de espermátides estaria disponível durante o procedimento experimental.
- No dia da dissecção, a transferência dos machos celibatários em uma placa NGM sem bactérias e deixá-los rastejar por alguns minutos. Este passo ajuda a remover pequena camada de E. coli aderidas na superfície de worms. Alternativamente, pipeta pequeno volume de tampão M9 (6g Na 2 HPO 4, 3g KH 2 PO 4, 5g de NaCl, 0,25 g MgSO 4 .7 H 2 O por litro) em um vidro de relógio e os machos de transferência para a reserva.
3) Dissecção do sexo masculino e na ativação in vitro
- Dê uma lâmina de vidro e marcar um pequeno círculo com uma caneta pap. Pipeta 30-50 mL de esperma Médio 1X (50 mM HEPES, 25mM KCl, 45mm NaCl, 1mM MgSO 4, CaCl 5mM 2, 10mM Dextrose; pH 7.8) dentro do círculo. O círculo hidrofóbico ajuda a manter a média de esperma dentro de sua fronteira.
- Transferir os machos 50-10 para o meio do esperma.
- Visualizando o slide ao microscópio, segure duas seringas anexado com 27 agulhas em ambas as mãos.
- Use uma agulha para 'hold' do verme e use a outra agulha para cortar a extremidade posterior dos machos para liberar espermátides.
- Corte o worm normalmente expele grande número de espermátides instantaneamente. O espermátides são visíveis como minuto grânulos "sob o microscópio estéreo. No entanto, por vezes, parte ou a maioria das espermátides podem ser retidos dentro da carcaça. Nesse caso, gentilmente 'arrastar' a carcaça sobre a lâmina de vidro podem facilitar a liberação de espermátides da carcaça.
- Para ativar o espermátides, dissecar o worms no Médio Esperma 1X contendo E pronase (20μg/ml) e deixe-os descansar por 5 minutos.
- Não permita que os slides para tornar-se seca em nenhum momento do experimento. Adicionar Médio Esperma mais 1X, se necessário.
4) Visualização de spermtids e espermatozóides
- Delicadamente, coloque uma lamela na superfície da amostra dissecados.
- Encontrar o campo de espermátides em pequeno aumento (10x)
- Detalhes de espermátides ou espermatozóides podem ser observadas movendo-se para maior ampliação - geralmente em imersão em óleo 100X.
5) Resultados Representante
Um exemplo de imagem DIC de espermátides isolado de C. elegans macho é mostrado na Figura 1. Espermátides são esféricas e os núcleos são proeminentes. In vitro de espermatozóides ativados são mostrados na Figura 2.
Figura 1. DIC imagem de C. espermátides elegans.
Figura 2. DIC de imagem in vitro ativada C. elegans espermatozóides.
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Discussion
Além de analisar os mutantes Spe, este protocolo tem outras aplicações importantes, tais como analisar a morfologia espermática com o envelhecimento. Espermátides e espermatozóides isolados usando este protocolo pode ser usado em outras experiências, como a jusante, imunocoloração do tipo selvagem e mutante de esperma 8, 9, motilidade do esperma em lâminas de 10, medidas fisiológicas 9, 11, ou até mesmo a inseminação artificial 12.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Samuel Ward, Diane C. Shakes e Gregory Nelson de pioneiro dessa técnica. Agradecemos a Pavan Kadandale e Brian Geldziler para vídeos mostrando espermatozóides ativados; membros do laboratório Singson para discussões úteis; CGC para as estirpes e NIH para apoiar-nos através de subvenção (R01HD054681).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
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