Summary
Ein Protokoll für die Isolierung und Aktivierung von Spermatiden von männlichen
Abstract
Männchen und Hermaphroditen sind die beiden natürlich vorkommende sexuelle Formen in dem Fadenwurm C. elegans. Die amöboiden Spermien werden sowohl Männchen als auch Hermaphroditen produziert. In der früheren Phase der Gametogenese, differenzieren die Keimzellen des Hermaphroditen in begrenzte Anzahl von Spermien - rund 300 - und sind in einer kleinen "Tasche" genannt Samentasche gespeichert. Später, Hermaphroditen kontinuierlich produzieren Eizellen 1. Im Gegensatz dazu produzieren Männer ausschließlich Samenzellen während ihres gesamten Erwachsenenalter. Die Männchen produzieren so viel Sperma, dass es für> 50% der gesamten Zellen in einer typischen erwachsenen Wurm 2 Konten. Deshalb isolieren Sperma von Männchen ist einfacher, als sich von Hermaphroditen.
Nur ein kleiner Teil der Männer sind von Natur erzeugt durch spontane nicht-Disjunktion von X Chromosom 3. Crossing Hermaphroditen mit Männchen oder komfortabel, die Einführung von Mutationen zu erheben, ihm zu geben (hohe Inzidenz von Rüden) Phänotyp sind einige der Strategien, durch die man die männliche Bevölkerung 3 bereichern können.
Männer können einfach von Hermaphroditen werden durch die Beobachtung der Schwanz Morphologie 4 aus. Zwitter Schwanz ist spitz, während die männlichen Schwanz mit passenden Strukturen abgerundet ist.
Cutting the tail Releases überwiegende Zahl der Spermatiden im männlichen Genitaltrakt gespeichert. Dissection wird unter einem Stereomikroskop mit 27-Gauge-Nadel durchgeführt. Da Spermatiden nicht physisch mit anderen Zellen verbunden, vertreibt hydraulische Druck internen Inhalt der männlichen Körpers, einschließlich Spermatiden 2.
Die Männchen sind direkt an einem kleinen Tropfen "Sperm Medium 'seziert. Spermatiden sind empfindlich gegenüber Veränderungen des pH-Wertes. Daher ist HEPES, eine Verbindung mit guter Pufferkapazität in Spermien Medien eingesetzt. Glucose und andere Salze, die in Spermien Medien zur Aufrechterhaltung des osmotischen Drucks, um die Integrität der Spermien zu erhalten.
Post-meiotischen Differenzierung der Spermatiden in Spermien ist Spermiogenese oder Sperma Aktivierung bezeichnet. Shakes 5 und 6 Nelson zuvor gezeigt, dass runden Spermatiden induziert werden können, in Spermien durch die Zugabe verschiedener aktivierende Verbindungen einschließlich Pronase E. Hier haben wir in vitro Spermiogenese von C. Beweis zu unterscheiden elegans Spermatiden mit Pronase E.
Erfolgreiche Spermiogenese ist Voraussetzung für die Fruchtbarkeit und damit die Mutanten in Spermiogenese sind steril. Bisher mehrere Mutanten konnte gezeigt werden, speziell in der Spermiogenese Verfahren 7 defekt. Abnormality gefunden während der in vitro Aktivierung der neuartigen Spe (Spermatogenese defekt) Mutanten würde uns helfen, zu entdecken zusätzliche Teilnehmer an dieser Veranstaltung.
Protocol
1) Anreicherung von männlichen Bevölkerung
- Abhängig von der experimentellen benötigen, können eine große Anzahl von Männern durch die Verwendung einer der folgenden Strategien erreicht werden:
- große Population von Wildtyp-Männchen können durch Kreuzung 5 Wild-Typ Rüden und 1 Zwitter auf einem kleinen Rasen ausgesät OP50 im Zentrum der NGM Platte erhalten werden. Rund 50% der nachfolgenden Generation wird Wildtyp-Männchen.
- ihm-5 (e1490) oder ihn-8 (e1489) Hermaphroditen werfen große Anzahl von Männern. ihn-5 und ihn-8 Männer sind fruchtbar und es gibt keinen offensichtlichen Mangel in Spermien Morphologie und Funktion. So, ihn-5 oder ihn-8 Männer können anstelle von Wildtyp-Männchen für viele Experimente verwendet werden.
2) Identifizierung und Isolierung von Männern
- Untersuchen Sie den Schwanz Morphologie von Würmern, die männliche Wurm Schwanz ist abgerundet.
- Pick-L4 Stadium Männer und Übertragung auf einen NGM-Platte ausgesät mit E. coli OP50 und lassen Sie sie für ein oder zwei Tage wachsen. Wachsende zölibatären Männern in der Abwesenheit von Hermaphroditen verhindern den Verlust von Spermien und damit große Anzahl von Spermatiden zur Verfügung stehen würde während der experimentellen Verfahren.
- Am Tag der Dissektion, übertragen Sie die zölibatär Männchen auf ein NGM Platte ohne Bakterien und lassen Sie sie für einige Minuten zu kriechen. Dieser Schritt hilft, kleine Schicht von E. entfernen coli auf der Oberfläche von Würmern eingehalten werden. Alternativ Pipette kleines Volumen von M9-Puffer (6g Na 2 HPO 4, 3g KH 2 PO 4, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO 4 .7 H 2 O pro Liter) in einem Uhrglas und Transfer Männer in den Puffer.
3) Dissection der Männer und in vitro Aktivierung
- Werfen Sie einen Objektträger aus Glas und markieren einen kleinen Kreis mit einem Pap-pen. Pipette 30-50 ul 1X Sperm Medium (50 mM HEPES, 25 mM KCl, 45mm NaCl, 1 mM MgSO 4, 5 mM CaCl 2, 10 mM Dextrose, pH 7,8) innerhalb des Kreises. Die hydrophoben Kreis hilft, die Spermien Medium innerhalb seiner Grenze zu behalten.
- Übertragung der 5-10 Männchen das Sperma Medium.
- Anzeigen der Folie unter dem Mikroskop, halten zwei Spritzen mit 27-Gauge-Nadeln auf beide Hände gebunden.
- Verwenden Sie eine Nadel auf "Hold"-Wurm und die andere Nadel bis zum hinteren Ende der Männer zugeschnitten Spermatiden freizugeben.
- Schneiden der Wurm in der Regel treibt große Anzahl von Spermatiden sofort. Die Spermatiden sichtbar sind als winzige "Körnchen" unter dem Stereomikroskop. Aber manchmal einen Teil oder die meisten der Spermatiden innerhalb der Karkasse beibehalten werden. In diesem Fall kann sanft 'Ziehen' der Karkasse über die Glas-Objektträger erleichtern die Freisetzung von Spermatiden von der Karkasse.
- Zur Aktivierung der Spermatiden, sezieren die Würmer in 1X Sperm Medium mit Pronase E (20μg/ml) und lassen Sie sie 5 Minuten lang sitzen.
- Lassen Sie die Folien werden zu jedem Zeitpunkt des Experiments trocken. Fügen Sie weitere 1X Sperm Medium, wenn nötig.
4) Visualisierung von spermtids und Samenzellen
- Sanft statt einem Deckglas auf der Oberfläche der präparierten Probe.
- Suchen Sie den Bereich der Spermatiden bei schwacher Vergrößerung (10X)
- In der Regel bei 100X Öl-Immersion - Feine Details der Spermatiden oder Spermatozoen können, indem sie zu höherer Vergrößerung beobachtet werden.
5) repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für DIC Bild der Spermatiden von männlichen C. elegans isoliert ist in Abbildung 1 dargestellt. Spermatiden sind kugelförmig und die Kerne sind prominent. In vitro aktivierten Spermien sind in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 1. DIC Bild von C. elegans Spermatiden.
Abbildung 2. DIC Bild in vitro aktiviert C. elegans Spermien.
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Discussion
Neben der Analyse Spe-Mutanten, hat dieses Protokoll andere wichtige Anwendungen, wie zB die Analyse Morphologie der Spermien mit zunehmendem Alter. Spermatiden und Spermien isoliert mit diesem Protokoll kann in anderen nachgeschalteten Experimenten wie verwendet werden, Immunfärbung von Wildtyp und Mutante Spermien 8, 9, Beweglichkeit der Spermien auf Objektträger 10, physiologische Messungen 9, 11 oder sogar künstliche Befruchtung 12.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Samuel Ward, Shakes Diane C. und Gregory Nelson für bahnbrechende dieser Technik. Wir danken Pavan Kadandale und Brian Geldziler für Videos, die aktiviert Spermien; Mitglieder der Singson Labor für hilfreiche Diskussionen, CGC für Stämme und NIH für die Unterstützung durch Grant (R01HD054681).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. , Vol. 48 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
