Summary
Un protocolo para el aislamiento y la activación de las espermátidas de varón
Abstract
Los varones y hermafroditas son las dos formas sexuales se encuentran naturalmente en el nematodo C. elegans. Los espermatozoides son ameboides producida tanto por hombres y hermafroditas. En la primera fase de la gametogénesis, las células germinales de los hermafroditas se diferencian en cantidad limitada de espermatozoides - alrededor de 300 - y se almacenan en una pequeña "bolsa" llama la espermateca. Más tarde, los hermafroditas producen continuamente ovocitos 1. Por el contrario, los machos producen exclusivamente espermatozoides durante toda su vida adulta. Los machos producen espermatozoides tanto que representa> 50% del total de células en un típico gusano de dos adultos. Por lo tanto, aislar los espermatozoides de los machos es más fácil que de la de los hermafroditas.
Sólo una pequeña proporción de los hombres son naturalmente generado debido a la espontánea no disyunción del cromosoma X 3. Cruzando hermafroditas con los hombres o, más convenientemente, la introducción de mutaciones que dan lugar a él (alta incidencia de varones) fenotipo son algunas de las estrategias a través del cual se puede enriquecer a la población masculina 3.
Los machos pueden distinguirse fácilmente de los hermafroditas mediante la observación de la morfología de la cola 4. La cola es hermafrodita en punta, mientras que la cola masculina se completa con las estructuras de apareamiento.
Corte de la cola libera gran cantidad de esperma almacenado en el interior del aparato reproductor masculino. La disección se realiza bajo un microscopio estéreo con agujas de calibre 27. Desde espermátidas no están físicamente conectados con cualquier otra célula, la presión hidráulica expulsa contenido interno del cuerpo masculino, incluyendo dos espermátidas.
Los machos son directamente disecados en una pequeña gota de "Medio de esperma". Espermátidas son sensibles a la alteración en el pH. Por lo tanto, HEPES, un compuesto con una buena capacidad de amortiguación se utiliza en los medios de esperma. La glucosa y otras sales presentes en los medios de comunicación ayudan a mantener el esperma presión osmótica para mantener la integridad de los espermatozoides.
Post-meiótica diferenciación de las espermátidas en espermatozoides se denomina espermiogénesis o la activación de los espermatozoides. Batidos 5, 6 y Nelson mostraron con anterioridad que espermátidas redondas pueden ser inducidas a diferenciarse en espermatozoides mediante la adición de diferentes compuestos como la activación de pronasa E. Aquí se demuestra in vitro espermiogénesis de C. elegans espermátidas con pronasa E.
Espermiogénesis éxito es pre-requisito para la fertilidad y por lo tanto, los mutantes defectuosos en la espermiogénesis son estériles. Hasta ahora, varios mutantes han demostrado que son defectuosos específicamente en el proceso de espermiogénesis 7. Anomalía encontrada durante la activación in vitro de la novela de SPE (espermatogénesis defectuosa) mutantes que nos ayuden a descubrir más jugadores que participan en este evento.
Protocol
1) El enriquecimiento de la población masculina
- Dependiendo de la necesidad de experimentación, un gran número de hombres se puede obtener mediante el empleo de una de las siguientes estrategias:
- gran población de hombres de tipo salvaje se puede obtener mediante el cruce 5 machos de tipo salvaje y hermafroditas 1 en un pequeño jardín de OP50 cabeza de serie en el centro de la placa de NGM. Aproximadamente el 50% de la generación siguiente serán hombres de tipo salvaje.
- él-5 (e1490) o lo-8 (e1489) hermafroditas lanzar gran cantidad de hombres. lo-5 y lo-8 machos son fértiles y no hay ningún defecto evidente en la morfología de los espermatozoides y función. Por lo tanto, él o ella-5-8 machos pueden ser utilizados en lugar de los hombres de tipo salvaje para muchos experimentos.
2) La identificación y el aislamiento de los hombres
- Examinar la morfología de la cola de los gusanos, la cola del gusano macho es redondeada.
- Elige L4 hombres etapa y la transferencia a un plato NGM sembradas con E. coli OP50 y dejarlas crecer por un día o dos. Cada vez los hombres célibes, en ausencia de hermafroditas evitar la pérdida de los espermatozoides y por lo tanto gran número de espermátidas estaría disponible durante el procedimiento experimental.
- En el día de la disección, la transferencia de los varones célibes sobre una placa de NGM sin bacterias y dejar que se arrastran durante unos minutos. Este paso ayuda a eliminar la pequeña capa de E. coli adheridos en la superficie de los gusanos. Por otra parte, el volumen de la pipeta pequeño de buffer M9 (6 g de Na 2 HPO 4, 3 g KH 2 PO 4, 5 g de NaCl, 0,25 g MgSO 4 .7 H 2 O por litro) en un vidrio de reloj y la transferencia de los hombres en el buffer.
3) La disección de los hombres y en la activación in vitro
- Tome un portaobjetos de vidrio y marca un pequeño círculo con un bolígrafo de Papanicolaou. Pipeta de 30 a 50 l de medio Sperm 1X (50 mM HEPES, 25 mM KCl, 45 mm de NaCl, 1 mM MgSO 4, 5 mM CaCl 2, 10 mM de dextrosa, pH 7.8) dentro del círculo. El círculo hidrofóbico ayuda a conservar el medio de esperma dentro de sus límites.
- La transferencia de los machos de 5-10 en el medio de los espermatozoides.
- Viendo la diapositiva bajo el microscopio, mantenga unido dos jeringas con agujas de calibre 27 en ambas manos.
- Use una aguja a 'mantener' el gusano y el uso de la otra aguja para cortar el extremo posterior de los hombres para liberar espermátidas.
- Cortar el gusano habitualmente expulsa gran cantidad de esperma de forma instantánea. Las espermátides son visibles como minuto "gránulos" bajo el microscopio estereoscópico. Sin embargo, a veces una parte o la mayoría de las espermátides pueden ser retenidos dentro de la carcasa. En ese caso, suavemente "arrastrando" el cadáver sobre el portaobjetos de vidrio, puede facilitar la liberación de esperma de la canal.
- Para activar las espermátides, diseccionar los gusanos en medio de esperma que contiene 1X E Pronasa (20μg/ml) y dejar que repose durante 5 minutos.
- No deje que los portaobjetos se sequen en ningún momento del experimento. Añadir media de esperma más 1X si es necesario.
4) Visualización de spermtids y espermatozoides
- Con cuidado, coloque un cubreobjetos sobre la superficie de la muestra disecada.
- Encontrar el campo de esperma en aumento bajo (10 veces)
- Los detalles finos de esperma o espermatozoides pueden ser observados por mudarse a un aumento mayor - por lo general en aceite de inmersión 100X.
5) Los resultados representativos
Un ejemplo de la imagen DIC de esperma masculino aislado de C. elegans se muestra en la Figura 1. Espermátidas son de forma esférica y los núcleos son prominentes. In vitro de esperma activo se muestran en la Figura 2.
Figura 1. DIC imagen de C. elegans espermátidas.
Figura 2. Imagen de DIC in vitro C activada elegans espermatozoides.
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Discussion
Además de analizar mutantes Espe, este protocolo tiene otras aplicaciones importantes, como el análisis de la morfología del espermatozoide con el envejecimiento. Espermátides y espermatozoides aislados utilizando este protocolo puede ser utilizado en otros experimentos posteriores, tales como, la inmunotinción de tipo salvaje y el espermatozoide mutante 8, 9, motilidad de los espermatozoides en las diapositivas 10, las mediciones fisiológicas 9, 11, o incluso la inseminación artificial 12.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Samuel Ward, Diane C. batidos y Gregory Nelson por ser pionero en esta técnica. Damos las gracias a Pavan Kadandale y Geldziler Brian de videos que muestran los espermatozoides activados, los miembros del laboratorio de Singson útil para los debates; CGC para las cepas y los NIH por su apoyo a través de la subvención (R01HD054681).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
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