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Biology

分离和激活线虫精子

doi: 10.3791/2336 Published: January 31, 2011

Summary

一个来自男性的精子细胞的分离和激活的协议

Abstract

男性和雌雄同体自然就找到了两种线虫线虫性形式。变形虫精子产生的男性和雌雄同体。在配子发生的早期阶段,雌雄同体的生殖细胞分化成精子数量有限 - 约300 - ,并存储在一个小的“袋”之称的精囊。后来,雌雄同体不断产生卵母细胞 1。相比之下,男性产生专其整个成年的精子。男性产生这么多的精子,它在一个典型的成虫 2细胞总数的50%帐户。因此,隔离来自男性的精子是较雌雄同体容易。

只有一小部分男性是自然产生自发的非分离的X 染色体 3 。隧道与男性或更方便,引入的突变引起他(男性的高发病率)表型的雌雄同体的一些战略,通过它可以丰富男性人口3。

男性可以很容易地区别于雌雄同体通过观察尾部形态4。指出,雌雄同体的尾巴,而雄性的尾巴是交配结构的圆形。

切割尾部释放广大男性生殖道内储存的精子。夹层使用27表针的立体显微镜下进行。由于精子是不是身体与任何其他细胞相连,液压排出内部的内容包括男性身体精子 2 。

男性有直接解剖上的“精子中等”的小降。精子细胞是敏感的pH值的改变。因此,HEPES,一种化合物具有良好的缓冲能力是精子媒体使用。葡萄糖和其他盐类存在于精子媒体帮助维持渗透压,保持精子的完整性。

被称为减数分裂后的精子细胞分化成精子的精子或精子激活。震撼5,6尼尔森先前表明,圆形精子细胞能够被诱导分化成精子,通过添加各种活性化合物,包括链霉蛋白酶大肠杆菌在这里, 我们证明体外精子的C 线虫精子使用链霉蛋白酶E。

成功的精子是生育的先决条件,因此,在精子缺陷的突变体是无菌的。迄今几个突变体已被证明特别是在有缺陷的精子形成过程7。异常时,发现在体外激活新型SPE(有缺陷的精子)的突变体,将有助于我们发现参与此事件的其他球员。

Protocol

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1)男性人口的富集

  1. 根据实验的需要,大量的男性可以得到采用以下策略之一:
    1. 人口众多的野生型男性可OP50种子NGM板中心的一个小草坪上穿过5野生型男性和1雌雄同体。大约50%的后代子孙将野生型的男性。
    2. 他5(e1490)他- 8(e1489)雌雄同体抛出大量的男性他的8男性肥沃的精子的形态和功能没有明显的缺陷。因此, 他的男性8例,代替野生型的男性,许多实验使用。

2)识别和隔离的男性

  1. 检查尾部形态的蠕虫,雄性蠕虫的尾巴是四舍五入。
  2. 选择L4阶段的男性,他们转移到与E. NGM板种子大肠杆菌 OP50和让他们成长为一两天。雌雄同体的情况下成长独身者在男性防止精子的损失,因此大量的精子会在实验过程中。
  3. 在一天的清扫,无细菌转移到NGM板独身的男性,并让他们爬几分钟。这一步,有助于消除 E.小层坚持对大肠杆菌的蠕虫病毒表面。另外,吸管M9的缓冲区(6克娜2 HPO 4,3G KH 2 PO 4,5G氯化钠,0.25克硫酸镁4 .7 H 2 O每公升)体积小,在手表玻璃和转移到缓冲区的男性。

3)夹层的男性和体外活化

  1. 载玻片和使用PAP笔标记一个小圆圈。吸取30-50μL精子中等1X(HEPES 50MM,25MM氯化钾,氯化钠45MM, 硫酸镁 1MM 5MM,10MM 氯化钙葡萄糖,pH值7.8)的圆圈内。疏水性循环,有助于保持在其边界内的精子中等。
  2. 5-10男性精子介质传输。
  3. 在显微镜下观看的幻灯片,按住两个注射器连接你的手都与27表针。
  4. 使用一根针“持有”的蠕虫和使用其他的针切男性结束后释放精子。
  5. 切割的蠕虫病毒,通常排出的精子大量瞬间。精子是分钟“颗粒”的立体显微镜下可见。但是,有时部分或大部分的精子可能会保留在胴体。在这种情况下,轻轻地“拖”的载玻片上的胴体,可能有助于释放精子的胴体。
  6. 要激活的精子细胞,解剖1X精子中等含链霉蛋白酶E(20μg/ml)的蠕虫,并让他们坐了5分钟。
  7. 不要让幻灯片成为干在任何时间点的实验。如果需要添加更多的1X精子中等。

4)可视化spermtids和精子

  1. 解剖样品表面轻轻放在盖玻片。
  2. 查找领域的精子在低倍率(10X)
  3. 迁移到更高的放大倍率 - 100X油浸通常可以观察到精子或精子的精细细节。

5)代表性的成果

DIC的男性线虫分离出精子形象的一个例子是如图1所示。精子细胞是球形的细胞核突出,在体外激活精子,如图2所示。

图1
图1 C. DIC的形象 线虫精子细胞。

图2
图2 在体外激活C. DIC的形象 线虫精子。

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Discussion

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除了分析SPE突变体,该协议有其他重要的应用,如精子形态分析与衰老。使用此协议的精子细胞和精子分离出可用于在其他下游实验,如野生型和突变体的精子8,9,幻灯片10, 生理测量9,11,甚至人工授精12精子活力的免疫。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们感谢,黛安C.塞缪尔沃德奶昔和格雷戈里纳尔逊这种技术的先驱。我们感谢帕Kadandale和布赖恩Geldziler视频显示激活精子,有益的讨论Singson实验室成员;株和美国国立卫生研究院的总部大楼为我们支持通过授予(R01HD054681)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tuberculin syringe BD Biosciences 309623 Syringe: 1 ml, needle:
27G X ½ in
Pap pen Zymed Laboratories, Inc. 00-8888
VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides VWR international 16004-406 Dimension:
75X25X1mm
Cover glass VWR international 48366045
Protease Sigma-Aldrich P-6911

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References

  1. Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
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  3. Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
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分离和<em在体外</em>激活<em>线虫</em>精子
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Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).More

Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).

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