Summary
Een protocol voor het isoleren en het activeren van spermatiden van man
Abstract
Mannen en hermafrodieten zijn de twee van nature seksuele vormen in de nematode C. elegans. De amoeboid zaadcellen worden geproduceerd door zowel mannen en hermafrodieten. In de vroegere fase van gametogenese, de kiemcellen van hermafrodieten differentiëren in een beperkt aantal zaadcellen - ongeveer 300 - en worden opgeslagen in een klein 'zakje' heet de spermatheca. Later, hermafrodieten steeds produceren eicellen 1. In tegenstelling, mannetjes produceren uitsluitend sperma tijdens hun volwassenheid. De mannetjes produceren zoveel sperma dat het goed is voor> 50% van de totale cellen in een typisch volwassen worm 2. Daarom, het isoleren van sperma van mannen is makkelijker dan van die van hermafrodieten.
Slechts een klein deel van de mannen zijn van nature te wijten aan spontane non-disjunctie van X-chromosoom 3 gegenereerd. Kruising hermafrodieten met mannetjes of meer gemakkelijk, de introductie van mutaties aanleiding kunnen geven tot Hem (hoge incidentie van mannetjes) fenotype zijn enkele strategieën waardoor men kan de mannelijke bevolking 3 verrijken.
Mannetjes kunnen gemakkelijk te onderscheiden van hermafrodieten door het observeren van de staart morfologie 4. Hermafrodiet de staart is spits, terwijl mannen staart is afgerond met de paring structuren.
Snijden van de staart releases enorme aantal spermatiden opgeslagen in het mannelijke reproductieve systeem. Dissectie wordt uitgevoerd onder een stereomicroscoop met 27 gauge naalden. Omdat spermatiden zijn niet fysiek verbonden met andere cellen, hydraulische verdrijft inwendige inhoud van de mannelijke lichaam, waaronder spermatiden 2.
Mannetjes zijn direct ontleed op een kleine druppel 'Sperma Medium'. Spermatiden zijn gevoelig voor verandering in de pH. Vandaar dat HEPES, een verbinding met een goede buffercapaciteit wordt gebruikt in het sperma media. Glucose en andere zouten aanwezig in het sperma media helpen handhaven osmotische druk om de integriteit van het sperma te behouden.
Post-meiotische differentiatie van spermatiden in de spermatozoa is genoemd spermiogenesis of sperma activering. Shakes 5, 6 en Nelson toonden eerder aan dat ronde spermatiden kan worden opgewekt om in spermatozoa onderscheiden door de toevoeging van verschillende verbindingen, waaronder het activeren van pronase E. Hier laten we zien in vitro spermiogenesis van C. elegans spermatiden gebruik pronase E.
Succesvolle spermiogenesis is randvoorwaarde voor de vruchtbaarheid en daarmee de mutanten defecte in spermiogenesis zijn steriel. Tot nu toe een aantal mutanten is aangetoond dat ze beschadigd zijn specifiek in spermiogenesis proces 7. Afwijkingen gevonden tijdens in vitro activatie van nieuwe Spe (spermatogenese defecte) mutanten ons zou helpen te ontdekken extra spelers die deelnemen aan dit evenement.
Protocol
1) Verrijking van de mannelijke bevolking
- Afhankelijk van de experimentele nodig hebt, kunnen grote aantallen mannen worden verkregen door gebruik wordt gemaakt van de volgende strategieën:
- grote populatie van wild-type mannetjes kunnen worden verkregen door het kruisen van 5 wild type reuen en een hermafrodiet op een klein grasveld van OP50 gezaaid in het centrum van NGM plaat. Ongeveer 50% van de volgende generatie zal zijn wild-type mannetjes.
- hem-5 (e1490), of hem-8 (e1489) hermafrodieten werpen groot aantal mannen. hem-5 en hem acht mannetjes zijn vruchtbaar en er is geen zichtbaar gebrek in sperma morfologie en functie. Dus, hem-5 of hem acht mannetjes kunnen worden gebruikt in plaats van wild type mannen voor veel experimenten.
2) Identificatie en isolatie van mannen
- Onderzoek de staart morfologie van wormen, de mannelijke worm de staart is afgerond.
- Pick L4 stadium mannetjes en overbrengen naar een NGM plaat bezaaid met E. coli laat OP50 en ze groeien voor een dag of twee. Groeiende celibataire mannen in de afwezigheid van hermafrodieten voorkomen dat het verlies van het sperma en dus groot aantal spermatiden beschikbaar zouden zijn tijdens de experimentele procedure.
- Op de dag van dissectie, de overdracht van de celibatair mannetjes op een NGM plaat zonder bacteriën en laat ze kruipen voor enkele minuten. Deze stap helpt bij het verwijderen kleine laag van E. coli aangehouden op het oppervlak van wormen. Als alternatief, pipet kleine volume van de M9 buffer (6 g Na 2 HPO 4, 3g KH 2 PO 4, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO 4 0.7 H 2 O per liter) in een horlogeglas en overdracht mannen in de buffer.
3) Dissection van de mannen en in vitro activatie
- Neem een glasplaatje en teken een kleine cirkel met behulp van een PAP pen. Pipetteer 30 tot 50 ul van 1X Sperma Medium (50 mM HEPES, 25mm KCl, 45mm NaCl, 1 mM MgSO 4, 5mM CaCl2, 10 mM glucose, pH 7,8) binnen de cirkel. De hydrofobe cirkel helpt bij het behouden van de sperma medium binnen de grens komt.
- Overdracht de 5-10 mannetjes op het sperma medium.
- Het bekijken van de foto onder de microscoop, houdt twee spuiten bevestigd met 27 gauge naalden op beide handen.
- Gebruik een naald om 'hold' van de worm en de andere naald te gebruiken om het achterste einde van de mannen gesneden spermatiden vrij te geven.
- Het snijden van de worm meestal verdrijft groot aantal spermatiden onmiddellijk. De spermatiden zijn zichtbaar als minuut 'korrels' onder de stereo microscoop. Echter, soms een deel of het grootste deel van de spermatiden kunnen worden bewaard in het karkas. In dat geval kan voorzichtig 'te slepen' het karkas over het glas schuift vergemakkelijken de afgifte van spermatiden van het karkas.
- Het activeren van de spermatiden, ontleden de wormen in 1X Sperma Medium met pronase E (20μg/ml) en laat ze zitten voor 5 minuten.
- Sta niet toe dat de dia's te droog worden op elk tijdstip van het experiment. Voeg meer 1X Sperma Medium indien nodig.
4) Visualisatie van spermtids en spermatozoa
- Plaats voorzichtig een dekglaasje op het oppervlak van ontleed monster.
- Zoek op het gebied van spermatiden onder lage vergroting (10x)
- Fijne details van spermatiden of spermatozoa kunnen worden waargenomen door naar hogere vergroting - meestal in 100x olie-immersie.
5) representatieve resultaten
Een voorbeeld van DIC beeld van spermatiden geïsoleerd van mannelijke C. elegans is weergegeven in figuur 1. Spermatiden zijn bolvormig en de kernen zijn prominent aanwezig. In vitro geactiveerd sperma zijn weergegeven in figuur 2.
Figuur 1. DIC beeld van C. elegans spermatiden.
Figuur 2. DIC beeld van in vitro geactiveerde C. elegans spermatozoa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In aanvulling op de analyse van Spe mutanten, dit protocol heeft ook andere belangrijke toepassingen, zoals het analyseren van sperma morfologie bij het ouder worden. Spermatiden en geïsoleerd spermatozoa met dit protocol kan worden gebruikt op andere downstream-experimenten, zoals, immunokleuring van wild-type en mutant sperma 8, 9, beweeglijkheid van sperma op dia's 10, fysiologische metingen 9, 11, of zelfs kunstmatige inseminatie 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Samuel Ward, Diane C. Shakes en Gregory Nelson voor baanbrekende deze techniek. Wij danken Pavan Kadandale en Brian Geldziler voor video's tonen geactiveerd spermatozoa, de leden van de Singson lab voor nuttige discussies; CGC voor de stammen en de NIH voor de ondersteuning van ons door subsidie (R01HD054681).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. , Vol. 48 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
