Summary
Un protocollo per l'isolamento e l'attivazione di spermatidi da maschio
Abstract
Maschi e ermafroditi sono le due forme naturalmente trovato sessuale nel nematode C. elegans. Lo sperma ameboidi sono prodotte da entrambi i maschi e ermafroditi. Nella prima fase della gametogenesi, le cellule germinali di ermafroditi differenziarsi in un numero limitato di spermatozoi - circa 300 - e sono memorizzati in una piccola 'borsa' chiamata spermateca. Più tardi, ermafroditi continuamente produrre ovociti 1. Al contrario, i maschi producono esclusivamente spermatozoi per tutta la loro età adulta. I maschi producono spermatozoi così tanto che rappresenta> 50% delle cellule totali in un tipico 2 verme adulto. Pertanto, isolare gli spermatozoi dei maschi è più facile che da quella di ermafroditi.
Solo una piccola percentuale di maschi sono naturalmente generati grazie alla spontanea non disgiunzione del cromosoma X 3. Crossing ermafroditi con i maschi o più comodamente, l'introduzione di mutazioni a dare origine a Lui (alta incidenza di maschi) fenotipo sono alcune delle strategie attraverso cui si può arricchire la popolazione maschile 3.
I maschi possono essere facilmente distinto da ermafroditi osservando i 4 morfologia coda. Coda ermafrodita è puntato, mentre la coda di sesso maschile è completato con le strutture di accoppiamento.
Taglio della coda rilascia vasto numero di spermatidi memorizzati all'interno del tratto riproduttivo maschile. La dissezione viene eseguita al microscopio stereo utilizzando aghi calibro 27. Dal momento che spermatidi non sono fisicamente connessi ad eventuali altre cellule, la pressione idraulica espelle contenuti interni del corpo maschile, tra cui spermatidi 2.
I maschi sono direttamente dissezionato in una piccola goccia di 'Medium sperma'. Spermatidi sono sensibili a variazioni del pH. Quindi, HEPES, un composto con una buona capacità tampone viene utilizzato nei media sperma. Glucosio e altri sali in ambiente sperma aiutare a mantenere la pressione osmotica per mantenere l'integrità degli spermatozoi.
Post-meiotico differenziazione delle spermatidi in spermatozoi è chiamato spermiogenesi o l'attivazione dello sperma. Scuote 5, 6 e Nelson precedentemente dimostrato che l'spermatidi possono essere indotte a differenziarsi in spermatozoi con l'aggiunta di composti tra cui l'attivazione di vari pronasi E. Qui mostriamo in vitro spermiogenesi di C. spermatidi elegans utilizzando pronasi E.
Spermiogenesi successo è pre-requisito per la fertilità e quindi i mutanti difetti di spermiogenesi sono sterili. Finora molti mutanti hanno dimostrato di essere difettoso in particolare nel processo di spermiogenesi 7. Anomalie rilevate durante l'attivazione in vitro di nuovi Spe (spermatogenesi difettoso) mutanti ci aiuterebbe a scoprire i giocatori aggiuntivi che partecipano a questo evento.
Protocol
1) Arricchimento della popolazione maschile
- A seconda delle esigenze sperimentali, un gran numero di maschi possono essere ottenuti utilizzando una delle seguenti strategie:
- vasta popolazione di maschi di tipo selvatico possono essere ottenuti incrociando 5 maschi e 1 wild-type ermafrodita su un piccolo prato di OP50 testa di serie al centro del piatto NGM. Circa il 50% della generazione successiva sarà maschi wild-type.
- lui-5 (e1490) o lo-8 (e1489) ermafroditi gettare gran numero di maschi. lui-5 e lo-8 maschi sono fertili e non ci sono difetti evidenti nella morfologia degli spermatozoi e la funzione. Quindi, lui-5 o lo-8 maschi possono essere utilizzati al posto dei maschi wild-type per molti esperimenti.
2) Identificazione e isolamento dei maschi
- Esaminare la morfologia della coda di vermi; coda del verme maschio è arrotondata.
- Scegli L4 maschi palco e trasferirli su un piatto NGM seminato con E. coli OP50 e farli crescere per un giorno o due. Crescere maschi celibi, in assenza di ermafroditi prevenire la perdita di sperma, e quindi gran numero di spermatidi sarebbe disponibile durante la procedura sperimentale.
- Il giorno della dissezione, trasferire i maschi celibi su un piatto NGM senza batteri e farli strisciare per pochi minuti. Questo passaggio consente di rimuovere piccolo strato di E. coli aderito sulla superficie dei vermi. In alternativa, il volume di piccole pipette di M9 tampone (6g Na 2 HPO 4, 3g KH 2 PO 4, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO 4 0,7 H 2 O per litro) in un vetro da orologio e maschi trasferimento nel buffer.
3) Dissezione dei maschi e attivazione in vitro
- Prendete un vetrino e segnare un piccolo cerchio con una penna pap. Pipettare 30-50 l di media sperma 1X (50 mM HEPES, 25mM KCl, 45mm NaCl, 1mM MgSO 4, 5mm CaCl 2, destrosio 10mM, pH 7.8) all'interno del cerchio. Il cerchio idrofobo aiuta a mantenere la media degli spermatozoi all'interno dei suoi limiti.
- Trasferire i maschi 50-10 al medio sperma.
- Guarda il vetrino al microscopio, tenere due siringhe attaccato con aghi calibro 27 in entrambe le mani.
- Utilizzare un ago a 'hold' il worm e utilizzare l'ago altra tagliare l'estremità posteriore dei maschi per liberare spermatidi.
- Taglio del verme di solito espelle vasto numero di spermatidi istantaneamente. Il spermatidi sono visibili come minute 'granuli' sotto il microscopio stereo. Tuttavia, a volte una parte o la maggior parte degli spermatidi possono essere conservati all'interno della carcassa. In questo caso, dolcemente 'trascinare' la carcassa il vetrino può facilitare il rilascio di spermatidi dalla carcassa.
- Per attivare il spermatidi, sezionare i vermi nel medio sperma 1X contenenti E pronasi (20μg/ml) e lasciarli riposare per 5 minuti.
- Non lasciare che le diapositive a diventare secco in un punto qualsiasi momento dell'esperimento. Add Media sperma più 1X, se necessario.
4) Visualizzazione spermtids e spermatozoi
- Delicatamente posto un coprioggetto sulla superficie del campione sezionato.
- Trovare il campo di spermatidi in basso ingrandimento (10X)
- Dettagli di spermatidi o spermatozoi può essere osservato da trasferirsi a maggiore ingrandimento - di solito a immersione in olio 100X.
5) Rappresentante Risultati
Un esempio di immagine DIC di spermatidi isolata dal maschio C. elegans è mostrata in Figura 1. Spermatidi sono di forma sferica ed i nuclei sono prominenti. Spermatozoi in vitro attivati sono mostrati nella Figura 2.
Figura 1. DIC immagine di C. elegans spermatidi.
Figura 2. DIC immagine in vitro attivato C. elegans spermatozoi.
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Discussion
Oltre ad analizzare mutanti Spe, questo protocollo ha altre importanti applicazioni, quali l'analisi della morfologia degli spermatozoi con l'invecchiamento. Spermatidi e spermatozoi isolati utilizzando questo protocollo può essere utilizzato in altri esperimenti a valle, come, immunocolorazione di tipo selvatico e sperma mutante 8, 9, la motilità degli spermatozoi nelle diapositive 10, misurazioni fisiologiche 9, 11, o anche l'inseminazione artificiale 12.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Samuel Ward, Diane C. Shakes e Gregory Nelson pionieristico per questa tecnica. Ringraziamo Pavan Kadandale e Brian Geldziler di video che mostrano gli spermatozoi attivi, i membri del laboratorio Singson per le discussioni utili; CGC per i ceppi e NIH per averci sostenuto con borsa (R01HD054681).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
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