Summary
男性から精子を分離し、活性化するためのプロトコル
Abstract
男性と雌雄同体の線虫 C. elegansの2つの自然に存在性的なフォームです。アメーバ精子は、男性と雌雄同体の両方で生産されています。約300 - - 配偶子形成の初期段階では、雌雄同体の生殖細胞は精子の数が限らへと分化し、貯精嚢と呼ばれる小さな"袋"に格納されています。その後、雌雄同体は、継続的に卵母細胞 1を生成する。対照的に、男性は自分の成人期を通じて独占的に精子生成。男性はそれが典型的な大人のワーム2の全細胞の> 50％を占めていることそんなに精子を生成する。したがって、男性から精子を分離する雌雄同体のものと比べて簡単です。
男性のわずかな割合は、自然にX染色体3の自発的な非分離のために生成されます。より便利に、男性またはで雌雄同体を横断、彼を生じさせる変異の導入（男性の発生率が高い）表現型は1つが男性の人口3を豊かにできるような戦略の一部です。
男性は、簡単に尾の形態4を観察することにより、雌雄同体と区別することができる。雄の尾部が嵌合構造で丸められるのに対し、両性具有の尾は、指摘されている。
テールをカットすると、雄の生殖器官の内部に格納されて精子細胞の膨大な数を解放します。解剖は、27ゲージの針を使用して実体顕微鏡下で行われる。精子細胞が物理的に他のセルと接続されていないので、油圧は精子2を含む男性の体の内部の内容を、排出します。
男性は、直接"精子の中"の小滴に解剖されています。精子は、pHの変化に敏感です。したがって、HEPES、良好な緩衝能を持つ化合物は、精子のメディアで使用されています。グルコースと精子のメディアに存在する他の塩は、精子の整合性を維持するために浸透圧を維持するのに役立ちます。
精子への精子の後の減数分裂分化は、精子や精子の活性化と呼ばれます。 5揺れ、そしてネルソン6以前に円形精子細胞はここでは、Cのin vitroでの精子で実証プロナーゼE.を含む様々な活性化合物を添加することにより精子に分化誘導できることを示したプロナーゼEを使用して線虫の精子
成功した精子は生殖能力の前提条件であり、したがって、精子形成の欠損変異株が無菌である。これまでいくつかの変異体は、特に精子形成の過程7で不良品であることが示されている。異常が小説SPE（精子形成の不良）のin vitroでの活性化に変異体は、私たちはこのイベントに参加する追加のプレーヤーを知る手助けになる際に発見。
Protocol
男性人口の1）濃縮
- 実験的な必要性に応じて、男性の多数は、次のいずれかの方法を用いることにより得ることができます。
- 野生型の雄の大規模な人口は、NGMプレートの中央にOP50シードの小さな芝生の5野生型の男性と1雌雄同体を横断することによって得ることができる。後続世代の約50％が野生型の男性になります。
- 彼- 5（e1490）または彼- 8（e1489）雌雄同体は彼- 5。男性の多数を投げると彼- 8男性は肥沃であり、精子の形態と機能には明らかな欠陥はありません。そう、 彼- 5または彼- 8の男性は、多くの実験のために野生型の男性の代わりに使用することができます。
男性の2）の同定と分離
- ワームの尾の形態を調べ、男性、ワームの尻尾は丸められます。
- L4ステージの男性を選んで、E.を接種したNGMプレートに移す大腸菌 OP50と、それらが一日か二日のために成長しましょう。雌雄同体の存在下で成長している独身男性は精子の損失を防ぐため、精子の数が多いが、実験手順の実行中に利用できるようになる。
- 解剖の日に、細菌なしでNGMプレートに上の独身男性を転送し、それらを数分間クロールができます。このステップでは、E.の小さい層を除去するのに役立ちます大腸菌は、ワームの表面に付着。また、バッファに時計のガラスと転送雄ではM9バッファー（1リットル当たり6グラムのNa 2 HPO 4、3G KH 2 PO 4、5グラムのNaCl、0.25グラムのMgSO 4 · 7H 2 O）のピペット少量。
3）男性とin vitroでの活性化の解剖は、
- スライドガラスを取り出し、PAPのペンを使って小さな円をマーク。ピペット1X精子中期の30〜50μL（50mmのHEPES、25mMのKClを、45ミリのNaCl、1mMのMgSO 4を用い 、5mMの塩化カルシウム、10mMのブドウ糖、pH7.8）中の円内。疎水性の円は、その境界内の精子の培地を維持するのに役立ちます。
- 精子の培地に5-10人の男性を転送します。
- 顕微鏡下でスライドを表示して、あなたの手の両方で27ゲージの針を取り付けた2つのシリンジを保持する。
- ワームを"ホールド"と精子を放出する男性の後端をカットするために他の針を使用するもの針を使用してください。
- ワームをカットすると、通常は瞬時に精子細胞の膨大な数を排出。精子細胞は、実体顕微鏡下で分"顆粒"として表示されます。しかし、時には一部または精子細胞のほとんどは、死体の中に保持されることがあります。その場合には、静かにスライドガラス上の死体"をドラッグすると、"死体からの精子の放出を容易にすることができる。
- 精子細胞を有効にするには、プロナーゼE（20μg/ml）を含む1X精子のミディアムでワームを細かく分析し、それらを5分間放置します。
- スライドは、実験の任意の時点でドライになるようにしてください。必要に応じてより多くの1X精子のミディアムを追加。
4）spermtidsと精子の可視化
- 優しく解剖試料の表面にカバースリップを配置。
- 低倍率（10倍）下で精子のフィールドを見つける
- 通常100X油浸で - 精子または精子の細部がより高い倍率に移動して観察することができます。
5）代表者の結果
男性の線虫から単離された精子のDIC画像の例を図1に示されています。精子は球形で、核が顕著である。 試験管内活性化の精子では 、図2に示す。
図1℃のDIC画像線虫の精子。
図2。 試験管内活性化C言語でのDIC画像elegansは精子。
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Discussion
SPE変異体を分析することに加えて、このプロトコルは、加齢に伴う精子の形態を分析するなど、他の重要なアプリケーションを、持っています。このプロトコルを使用して単離した精子と精子は野生型と変異体精子8、9、スライド10、生理学的測定9、11、あるいは人工授精12日の精子の運動性の免疫染色、などの他の下流の実験に使用することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、サミュエルウォードに感謝、ダイアンC.はこの手法を開拓するためシェイクスとグレゴリーネルソン。我々は、活性化精子を示すビデオをパヴァーヌKadandaleとブライアンGeldzilerに感謝、有用な議論のためのシンソンの研究室のメンバーは、CGC株とNIHの助成金（R01HD054681）を通じて私たちをサポートするために。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
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