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Biology

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

doi: 10.3791/2336 Published: January 31, 2011

Summary

Um protocolo para isolar e ativando espermátides de macho

Abstract

Machos e hermafroditas são as duas formas encontradas naturalmente sexual na nemátodo C. elegans. Os espermatozóides amebóides são produzidos por machos e hermafroditas. Na fase anterior do gametogênese, as células germinativas dos hermafroditas diferenciar em número limitado de espermatozóides - cerca de 300 - e são armazenados em um "saco" pequena chamada espermateca. Mais tarde, os hermafroditas produzem continuamente oócitos 1. Em contraste, os homens produzem espermatozóides durante toda a sua exclusiva idade adulta. Os machos produzem espermatozóides tanto que representa> 50% do total de células em um 2 adulto típico worm. Portanto, isolar os espermatozóides dos machos é mais fácil do que da de hermafroditas.

Apenas uma pequena proporção dos machos são naturalmente gerados devido à espontânea de não-disjunção do cromossomo X 3. Cruzamento com os machos hermafroditas ou mais convenientemente, a introdução de mutações a dar origem a Ele (alta incidência de machos) fenótipo são algumas das estratégias através das quais pode-se enriquecer a população masculina 3.

Os machos podem ser facilmente distinguidos dos hermafroditas, observando os 4 morfologia da cauda. Cauda hermafrodita é apontado, ao passo que no sexo masculino é de cauda arredondada com estruturas de acasalamento.

Corte a cauda libera grande número de espermátides armazenada dentro do trato reprodutivo masculino. Dissecção é realizada sob um microscópio estéreo com 27 agulhas. Desde espermátides não estão fisicamente conectados com quaisquer outras células, a pressão hidráulica expele o conteúdo interno do corpo masculino, incluindo espermátides 2.

Os machos são diretamente dissecado em uma pequena gota de 'Medium esperma'. Espermátides são sensíveis a alteração no pH. Assim, HEPES, um composto com boa capacidade de tamponamento é utilizada nos meios de comunicação de esperma. Glicose e outros sais presentes na mídia esperma ajudar a manter a pressão osmótica para manter a integridade dos espermatozóides.

Pós-meiótica diferenciação de espermátides em espermatozóides é denominado espermiogênese ou ativação de esperma. Shakes 5, 6 e Nelson anteriormente mostrou que espermátides arredondadas podem ser induzidas a se diferenciarem em espermatozóides pela adição de compostos de ativar diversos, incluindo pronase E. Aqui demonstramos in vitro espermiogênese de C. espermátides elegans utilizando pronase E.

Espermiogênese de sucesso é pré-requisito para a fertilidade e, portanto, os mutantes defeituosos em espermiogênese são estéreis. Até então vários mutantes foram mostrados para ser defeituoso, especificamente no processo de espermiogênese 7. Anormalidade encontrada durante a ativação in vitro de romance Spe (Espermatogênese defeituoso) mutantes iria nos ajudar a descobrir jogadores adicionais participar neste evento.

Protocol

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1) O enriquecimento da população masculina

  1. Dependendo da necessidade experimental, um grande número de homens pode ser obtida através do emprego de uma das seguintes estratégias:
    1. grande população de machos do tipo selvagem pode ser obtida através do cruzamento 5 machos tipo selvagem e um hermafrodita em um gramado pequeno de OP50 semeado no centro da placa NGM. Cerca de 50% da geração seguinte será do sexo masculino do tipo selvagem.
    2. ele-5 (e1490) ou ele-8 (e1489) hermafroditas jogar grande número de machos.-lo-5-8 e ele os machos são férteis e não há nenhum defeito óbvio na morfologia espermática e função. Então, ele-5 ou ele-8 do sexo masculino pode ser usado no lugar de homens do tipo selvagem de muitos experimentos.

2) Identificação e isolamento dos machos

  1. Examinar a morfologia da cauda de vermes; cauda do verme macho é arredondada.
  2. Escolha L4 machos palco e transferi-los para uma placa NGM semeado com E. coli OP50 e deixá-los crescer para um dia ou dois. Crescente homens celibatários na ausência de hermafroditas evitar a perda de esperma e, assim, grande número de espermátides estaria disponível durante o procedimento experimental.
  3. No dia da dissecção, a transferência dos machos celibatários em uma placa NGM sem bactérias e deixá-los rastejar por alguns minutos. Este passo ajuda a remover pequena camada de E. coli aderidas na superfície de worms. Alternativamente, pipeta pequeno volume de tampão M9 (6g Na 2 HPO 4, 3g KH 2 PO 4, 5g de NaCl, 0,25 g MgSO 4 .7 H 2 O por litro) em um vidro de relógio e os machos de transferência para a reserva.

3) Dissecção do sexo masculino e na ativação in vitro

  1. Dê uma lâmina de vidro e marcar um pequeno círculo com uma caneta pap. Pipeta 30-50 mL de esperma Médio 1X (50 mM HEPES, 25mM KCl, 45mm NaCl, 1mM MgSO 4, CaCl 5mM 2, 10mM Dextrose; pH 7.8) dentro do círculo. O círculo hidrofóbico ajuda a manter a média de esperma dentro de sua fronteira.
  2. Transferir os machos 50-10 para o meio do esperma.
  3. Visualizando o slide ao microscópio, segure duas seringas anexado com 27 agulhas em ambas as mãos.
  4. Use uma agulha para 'hold' do verme e use a outra agulha para cortar a extremidade posterior dos machos para liberar espermátides.
  5. Corte o worm normalmente expele grande número de espermátides instantaneamente. O espermátides são visíveis como minuto grânulos "sob o microscópio estéreo. No entanto, por vezes, parte ou a maioria das espermátides podem ser retidos dentro da carcaça. Nesse caso, gentilmente 'arrastar' a carcaça sobre a lâmina de vidro podem facilitar a liberação de espermátides da carcaça.
  6. Para ativar o espermátides, dissecar o worms no Médio Esperma 1X contendo E pronase (20μg/ml) e deixe-os descansar por 5 minutos.
  7. Não permita que os slides para tornar-se seca em nenhum momento do experimento. Adicionar Médio Esperma mais 1X, se necessário.

4) Visualização de spermtids e espermatozóides

  1. Delicadamente, coloque uma lamela na superfície da amostra dissecados.
  2. Encontrar o campo de espermátides em pequeno aumento (10x)
  3. Detalhes de espermátides ou espermatozóides podem ser observadas movendo-se para maior ampliação - geralmente em imersão em óleo 100X.

5) Resultados Representante

Um exemplo de imagem DIC de espermátides isolado de C. elegans macho é mostrado na Figura 1. Espermátides são esféricas e os núcleos são proeminentes. In vitro de espermatozóides ativados são mostrados na Figura 2.

Figura 1
Figura 1. DIC imagem de C. espermátides elegans.

Figura 2
Figura 2. DIC de imagem in vitro ativada C. elegans espermatozóides.

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Discussion

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Além de analisar os mutantes Spe, este protocolo tem outras aplicações importantes, tais como analisar a morfologia espermática com o envelhecimento. Espermátides e espermatozóides isolados usando este protocolo pode ser usado em outras experiências, como a jusante, imunocoloração do tipo selvagem e mutante de esperma 8, 9, motilidade do esperma em lâminas de 10, medidas fisiológicas 9, 11, ou até mesmo a inseminação artificial 12.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos a Samuel Ward, Diane C. Shakes e Gregory Nelson de pioneiro dessa técnica. Agradecemos a Pavan Kadandale e Brian Geldziler para vídeos mostrando espermatozóides ativados; membros do laboratório Singson para discussões úteis; CGC para as estirpes e NIH para apoiar-nos através de subvenção (R01HD054681).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tuberculin syringe BD Biosciences 309623 Syringe: 1 ml, needle:
27G X ½ in
Pap pen Zymed Laboratories, Inc. 00-8888
VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides VWR international 16004-406 Dimension:
75X25X1mm
Cover glass VWR international 48366045
Protease Sigma-Aldrich P-6911

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References

  1. Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
  2. Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. Vol. 48 273-301 (1995).
  3. Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
  4. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
  5. Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
  6. Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
  7. L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
  8. Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
  9. Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
  10. Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
  11. Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
  12. LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
Isolamento e<em> In vitro</em> A ativação do<em> Caenorhabditis elegans</em> Sperm
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Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).More

Singaravelu, G., Chatterjee, I., Marcello, M. R., Singson, A. Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm. J. Vis. Exp. (47), e2336, doi:10.3791/2336 (2011).

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