Summary
Ett protokoll för isolering och aktivera spermatider från manliga
Abstract
Män och hermafroditer är de två som finns naturligt sexuella former i nematoden C. elegans. Den amöboid spermier produceras av både män och hermafroditer. I den tidigare fasen av gametogenes, könscellerna av hermafroditer differentieras till begränsat antal spermier - runt 300 - och lagras i en liten "väska" som kallas spermatheca. Senare hermafroditer kontinuerligt producera ägg 1. Däremot män producerar uteslutande spermier under hela vuxenlivet. Hanarna producerar så mycket sperma att det står för> 50% av den totala celler i en typisk vuxen mask 2. Därför isolera spermier från män är lättare än den som använts för hermafroditer.
Endast en liten andel män är naturligtvis genereras på grund av spontana icke-disjunktion av X-kromosom 3. Crossing hermafroditer med män eller mer bekvämt, införandet av mutationer kan ge upphov till Honom (hög förekomst av hanar) fenotyp är några av strategier genom vilka man kan berika den manliga befolkningen 3.
Hanar kan lätt skiljas från hermafroditer genom att observera 4 svansen morfologi. Hermafrodit svans är spetsiga, medan manliga svans avrundas med parning strukturer.
Kapning svansen släpper stora antalet spermatider lagras i manliga genitalia. Dissektion utförs under lupp med 27 gauge nålar. Eftersom spermatider inte är fysiskt sammankopplade med andra celler, fördriver hydraultryck interna innehållet i manliga kroppen, inklusive spermatider 2.
Hanarna är direkt dissekeras på en liten droppe "Sperm Medium". Spermatider är känsliga för förändringar i pH. Därför är HEPES, en förening med god buffertkapacitet används i spermier medier. Glukos och andra salter som finns i spermier medier bidra till att upprätthålla osmotiskt tryck att bibehålla integriteten av spermier.
Post-meiotiska differentiering av spermatider in spermier kallas spermiogenesis eller spermier aktivering. Skakningar 5, och Nelson 6 tidigare visat att runt spermatider kan fås att differentieras till spermier genom att lägga till olika aktivera föreningar inklusive Pronase E. Här visar vi in vitro spermiogenesis av C. elegans spermatider med Pronase E.
Framgångsrik spermiogenesis är förutsättning för fruktbarhet och därmed mutanter defekt i spermiogenesis är sterilt. Hittills flera mutanter har visat sig vara defekta specifikt i spermiogenesis processen 7. Onormalt upptäcks vid in vitro-aktivering av nya Spe (spermatogenesen defekt) mutanter skulle hjälpa oss att upptäcka ytterligare spelare som deltar i detta evenemang.
Protocol
1) Anrikning av manliga befolkningen
- Beroende på den experimentella behöver, kan ett stort antal män uppnås genom att använda någon av följande strategier:
- stor population av vilda typen hanar kan erhållas genom att korsa 5 vildtyp hanar och en hermafrodit på en liten gräsmatta med OP50 seedas i centrum av NGM plattan. Ungefär 50% av den efterföljande generation kommer att vara vild typ manlig.
- honom-5 (e1490) eller honom-8 (e1489) hermafroditer kasta stort antal män. honom-5 och honom-8 hanar är bördig och det finns inget självklart fel i spermiernas morfologi och funktion. Så, han-5 eller honom-8 kan hanar användas i stället för vildtyp män för många experiment.
2) Identifiering och isolering av män
- Undersök svansen morfologi av maskar, den manliga masken svans är rundad.
- Plocka L4 skede hanar och överföra dem till ett NGM tallrik ympats med E. coli OP50 och låta dem växa under en dag eller två. Växande celibat män i avsaknad av hermafroditer förhindra förlust av spermier och därmed stort antal spermatider skulle finnas tillgängliga under experimentell procedur.
- På dagen för dissektion, överföra celibat hanar på en NGM tallrik utan bakterier och låt dem krypa i några minuter. Detta steg hjälper till att ta bort små lager av E. coli levt på ytan av maskar. Alternativt pipett liten mängd M9 buffert (6g Na 2 HPO 4, 3g KH 2 PO 4, 5g NaCl, 0.25g MgSO 4 0,7 H 2 O per liter) i ett urglas och hanar överföring till bufferten.
3) dissekering av män och in vitro-aktivering
- Ta en glasskiva och markera en liten cirkel med en pap penna. Pipettera 3-50 l 1X spermier Medium (50 mm HEPES, 25mm KCl, 45mm NaCl, 1mm MgSO 4, 5mm CaCl 2, 10mm dextros, pH 7,8) inom cirkeln. Den hydrofoba cirkeln hjälper till att bibehålla sperma mediet inom dess gränser.
- Överför 5-10 hanar på spermierna medium.
- Visar bilden under mikroskop, håll två sprutor fäst med 27 gauge nålar på båda händerna.
- Använd en nål för att "hålla" masken och använda den andra nålen för att klippa den bakre änden av män att släppa spermatider.
- Kapning masken oftast fördriver stort antal spermatider omedelbart. Den spermatider syns som minuts korn "under lupp. Men ibland en del eller de flesta av spermatider får behållas inom kroppen. I så fall kan du försiktigt "dra" kadavret över glasskiva underlätta frisläppandet av spermatider från stommen.
- För att aktivera spermatider, dissekera maskar i 1X Spermier medium som innehåller Pronase E (20μg/ml) och låta dem sitta i 5 minuter.
- Låt inte bilderna att bli torr vid någon tidpunkt av försöket. Lägg till fler 1X Spermier Medium om det behövs.
4) Visualisering av spermtids och spermier
- Placera försiktigt ett täckglas på ytan av dissekeras prov.
- Hitta området spermatider i låg förstoring (10X)
- Fina detaljer spermatider eller spermier kan ses genom att flytta till större förstoring - vanligtvis vid 100X oljeimmersion.
5) representativa resultat
Ett exempel på DIC bild av spermatider isolerade från manliga C. elegans visas i figur 1. Spermatider är klotformig och kärnan är framträdande. In vitro aktiverad spermier visas i figur 2.
Figur 1. DIC bild av C. elegans spermatider.
Figur 2. DIC bild av in vitro-aktiverade C. elegans spermier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förutom att analysera Spe mutanter, har detta protokoll andra viktiga program, till exempel analysera spermamorfologin med åldrandet. Spermatider och isolerade spermier med hjälp av det här protokollet kan användas i andra nedströms experiment som, immunfärgning av vildtyp och muterade spermier 8, 9, motilitet spermier på bilderna 10, fysiologiska mätningar 9, 11, eller till och med insemination 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Samuel Ward, skakar Diane C. och Gregory Nelson för banbrytande denna teknik. Vi tackar Pavan Kadandale och Brian Geldziler för videor som visar aktiveras spermier, medlemmar av Singson labb för bra diskussioner, CGC för stammar och NIH för att stödja oss genom bidrag (R01HD054681).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. , Vol. 48 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
