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Biology

Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali

Published: December 8, 2010 doi: 10.3791/2344
* These authors contributed equally

Summary

Le cellule staminali pluripotenti in crescita in sospensione differenziarsi in corpi embrionali (EBS). Qui mostriamo come ottenere criosezioni EB alta qualità utile per lo studio di aspetti cellulari e molecolari della embriogenesi, pur mantenendo la propria organizzazione come aggregati.

Abstract

Staminali embrionali (ES), le cellule sono cellule pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna della blastocisti, stadio embrioni precoci di mammifero 1. Una fase cruciale nella differenziazione delle cellule staminali embrionali è la formazione di corpi embrionali (EBS) aggregati 2, 3. Formazione di EB è basato su aggregazione spontanea quando le cellule ES sono coltivate in piastre non aderente. Tridimensionale ricapitola EB molti aspetti dei primi embriogenesi dei mammiferi e di differenziarsi nei tre foglietti embrionali: ectoderma, mesoderma ed endoderma 4.

Immunofluorescenza e ibridazione in situ sono ampiamente utilizzate tecniche per la rilevazione di proteine ​​bersaglio e di mRNA presenti nelle cellule di una sezione di tessuto 5, 6, 7. Qui vi presentiamo una semplice tecnica per generare criosezioni alta qualità dei corpi embrionali. Questo approccio si basa su l'orientamento spaziale di incorporare EB in ottobre seguita dalla tecnica cryosection. Le sezioni risultante può essere sottoposto a una vasta gamma di procedure analitiche per caratterizzare popolazioni di cellule che contengono alcune proteine, RNA o DNA. In questo senso, la preparazione di criosezioni EB (10μm) sono strumenti essenziali per l'analisi colorazione istologia (ad esempio Hematoxilin e eosina, DAPI), immunofluorescenza (ad esempio Oct4, nestina) o ibridazione in situ. Questa tecnica può anche aiutare a capire gli aspetti della embriogenesi per quanto riguarda il mantenimento del tri-dimensionale struttura sferica di EBS.

Protocol

1. Fissazione e Crioconservazione

Cellule staminali pluripotenti sono state coltivate su fibroblasti embrionali del mouse (MEF) inattivato con mitomicina C e mantenuti in DMEM/F12 integrato con la sostituzione ad eliminazione diretta il 20% siero (KSR) e 8ng / mL di fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-2). Al fine di indurre la formazione di EB cellule H9 sono stati trasferiti a non aderente piatti e coltura per 7 giorni, mantenuti in DMEM/F12 integrato con il 15% KSR 8.

Nota (!): Questa tecnica può essere usata per EB derivato da cellule pluripotenti indotte embrionali e staminali.

  1. Raccogliere l'EBS dal piatto cultura con una pipetta.
  2. EB trasferimento in una provetta da 15 ml conica e attendere che il materiale si deposita sul fondo della provetta.
  3. Rimuovere medie e fissare EB con paraformaldeide 4% (PFA), soluzione in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
    Nota (!): Per recupero in situ di ibridazione antigene deve essere fatto al fine di evitare reazione incrociata legame con gli anticorpi a causa dell'uso di PFA 6,7.
  4. Rimuovere la soluzione PFA e lavare con PBS per 5 min.
  5. EB deve essere posizionato in diluizione seriale di PBS-buffered soluzioni di saccarosio (10, 20 e 30%, in sequenza) a 25-28 ° C, ogni soluzione deve essere sostituita ogni 30 min. Il materiale può essere stoccato in soluzione di saccarosio 30% a 4 ° C fino al passaggio integrazione con dispositivi ottobre

2. Incorporare tessuto, orientamento e congelamento

  1. Raccogliere accuratamente EBS dal tubo. Scarica soluzione di saccarosio, per quanto possibile.

    Nota (!): E 'importante bagnare la parete interna della punta con una soluzione di saccarosio prima di raccogliere l'EBS. Questa procedura può evitare EB da allegare alla punta.
  2. EB posto nello stampo e rimuovere soluzione di saccarosio restante con carta da filtro.

    Nota (!): E 'importante non riempire lo stampo con EBS per evitare sovrapposizioni.
  3. Riempire stampo con ottobre lentamente, facendo attenzione a non risospendere EBS. Dopo di che, posto tutti EB al centro dello stampo e rimuovere le bolle con la pipetta.
  4. Agitare leggermente per 15 minuti.
  5. Circondano lo stampo con ghiaccio tritato secco di congelare il campione. Ottobre dovrebbe essere completamente ghiacciato. A questo punto i blocchi possono essere conservati a -70 ° C, per almeno un anno.

3. Criosezionamento Tecnica

  1. Rimuovere il blocco congelato da -70 ° C e luogo il criostato precedentemente raffreddato ad una temperatura tra -18 e -21 ° C.

    Nota (!): Temperature fuori di questo intervallo può causare problemi come le sezioni di curling, di fusione o screpolature.
  2. Staccare il blocco ottobre dallo stampo e mettetelo nel supporto criostato con l'aggiunta di ulteriori ottobre
  3. E 'importante per orientare correttamente il blocco e allinearlo parallelamente al bordo della lama.

    Nota (!): Come EB sono più piccole rispetto ai campioni di altri tessuti, questo passo è estremamente importante per minimizzare la perdita di materiale.
  4. Blocchi di ottobre dovrebbe essere sezionato superficialmente fino al piano della superficie è ottenuta. Sezioni sottili (10μm) del campione di tessuto devono essere prese e montate su vetrini precedentemente rivestito con 200 mg / mL poli L lisina (10 L per vetrino) 9,10.

    Nota (!): Per evitare sezioni torned prestare attenzione a eventuali danni alla lama.
  5. Tutte le sezioni devono essere essiccati all'aria per 1 ora a temperatura ambiente e poi essere utilizzato o conservato a -70 ° C fino al momento dell'uso.

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Discussion

Il metodo qui descritto fornisce un facile da seguire il protocollo di ottenere PFA fisso criostato sezioni sottili di corpi embrionali utili per immunofluorescenza e saggi di ibridazione in situ. Il criosezioni risultante permesso lo studio degli aspetti cellulari e molecolari del differenziamento delle cellule staminali embrionali umane, pur mantenendo la loro struttura e organizzazione come aggregati.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo uno Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Siamo grati a S. Bruna Paulsen e Aline M. Fernandes per le immagini EB.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
D (+) Sucrose Reagent Vetec 228
Paraformaldehyde Reagent Rieden-de Haën 16005
PBS solution Reagent LGC Biotecnology 13-30259.05
Poly-L-lysine hydrobromide Reagent Sigma-Aldrich P2636 200mg/mL in water
Tissue-Tek O.C.T. Compound Reagent Sakura Finetek P2636
Sucrose Solution Reagent 10% Sucrose Solution in PBS w/v
Sucrose Solution Reagent 20% Sucrose Solution in PBS w/v
Sucrose Solution Reagent 30% Sucrose Solution in PBS w/v
Conic Tube Tool Techno Plastic Products 91015 15mL conic tube
Plate shaker Tool Biomixer
Cryostat Tool Leica Microsystems CM 1850
Mold for OCT platform Tool Plastic mold plataform

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References

  1. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
  2. Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
  3. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
  4. Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
  5. Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
  6. Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
  7. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
  8. Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
  9. Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
  10. Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).

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Biologia dello Sviluppo Numero 46 le cellule staminali embrionali il corpo embrionali criosezioni immunochytochemistry H9
Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali
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Gomes, I. C., Acquarone, M., Maciel, More

Gomes, I. C., Acquarone, M., Maciel, R. d. M., Erlich, R. B., Rehen, S. K. Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (46), e2344, doi:10.3791/2344 (2010).

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