Summary
الخلايا الجذعية المحفزة المتنامي في تعليق تفرق في الهيئات مضغي الشكل (EBS). نحن هنا لشرح كيفية الحصول على جودة عالية cryosections EB مفيدة لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية لمرحلة التطور الجنيني ، مع الحفاظ على مؤسساتهم والمجاميع.
Abstract
الجذعية الجنينية (ES) الخلايا هي الخلايا المحفزة المستمدة من كتلة الخلايا الداخلية للأجنة في مرحلة الكيسة أوائل الثدييات 1. مرحلة حاسمة في التفريق بين الخلايا وفاق هو تشكيل هيئات مضغي الشكل (EBS) المجاميع 2 ، 3. ويستند تشكيل المجلس التنفيذي على تجميع عفوية عندما يتم استزراع خلايا ES في لوحات غير ملتصقة. يلخص EB ثلاثي الأبعاد جوانب كثيرة من الثدييات الجنيني المبكر ، والتفريق في الطبقات الجرثومية الثلاث : الأديم الظاهر ، الأديم المتوسط والأديم الباطن 4.
وتستخدم على نطاق واسع والمناعي في الموقع التهجين التقنيات للكشف عن الهدف والبروتينات الموجودة في خلايا مرنا من قسم النسيج 5 ، 6 ، 7. نقدم هنا تقنية بسيطة لتوليد cryosections عالية الجودة للهيئات مضغي الشكل. هذا النهج يعتمد على التوجه المكاني لتضمين EB في أكتوبر تليها تقنية cryosection. يمكن أن يتعرض المقاطع مما أدى إلى طائفة واسعة من الإجراءات التحليلية من أجل تميز السكان من الخلايا التي تحتوي على بروتينات معينة ، أو الحمض النووي الريبي DNA. في هذا المعنى ، وإعداد cryosections EB (10μm) هي الأدوات الأساسية للتحليل تلطيخ الأنسجة (مثلا Hematoxilin ويوزين ، دابي) ، المناعي (مثل Oct4 ، nestin) أو التهجين في الموقع. هذه التقنية يمكن أن يساعد أيضا في فهم جوانب من مرحلة التطور الجنيني فيما يتعلق بالحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد كروية EBS.
Protocol
1. التثبيت والحفظ بالتبريد
ومثقف الخلايا الجذعية المحفزة على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) المعطل مع C mitomycin والمحافظة عليها في DMEM/F12 تستكمل مع خروج المغلوب استبدال 20 ٪ المصل (KSR) و8ng / مل من عامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل - 2). من أجل حمل EB تشكيل نقلوا H9 الخلايا غير ملتصقة الأطباق وتربيتها لمدة 7 أيام ، في الحفاظ على DMEM/F12 تستكمل مع 15 ٪ KSR 8.
مذكرة (!) : يمكن استخدام هذه التقنية لEBS المستمدة من أي خلية جذعية جنينية والمحفزة التي يسببها.
- جمع EBS من الطبق مع ثقافة ماصة.
- نقل EBS لأنبوب مخروطي 15 مل وانتظر حتى البواليع المواد إلى أسفل الأنبوب.
- إزالة المتوسطة والإصلاح EBS مع بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) الحل في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
مذكرة (!) : للحصول على الانتعاش في الموقع التهجين مستضد ينبغي القيام به من أجل تجنب رد فعل عبر الربط مع الأجسام المضادة نتيجة لاستخدام 6،7 PFA. - إزالة PFA حل ويغسل مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- ينبغي أن توضع في التخفيف EBS التسلسلي PBS - مخزنة حلول السكروز (10 و 20 و 30 ٪ ، في تسلسل) في 25-28 درجة مئوية ، ويجب أن يتم استبدال كل حل كل 30 دقيقة. ويمكن بعد ذلك أن المواد المخزونة في حل السكروز 30 ٪ في 4 درجات مئوية حتى مع تضمين الخطوة أكتوبر
2. التضمين الأنسجة ، والإرشاد والتجميد
- جمع بعناية EBS من الأنبوب. حل السكروز تصريف أكبر قدر ممكن.
مذكرة (!) : من المهم أن الرطب الجدار الداخلي للطرف بمحلول سكروز قبل جمع EBS. ويمكن تجنب هذا الإجراء EB أن تعلق على الحافة. - مكان EBS في قالب وإزالة ما تبقى الحل السكروز مع ورقة التصفية.
مذكرة (!) : من المهم عدم ملء القالب مع EBS لتجنب التداخل. - ملء القالب مع أكتوبر ببطء ، مع الحرص على عدم اعادة تعليق EBS. بعد ذلك ، ضع كافة EB في وسط العفن وإزالة فقاعات مع ماصة.
- تستنهض الهمم معتدلة لمدة 15 دقيقة.
- تحيط قالب الثلج الجاف مع سحق لتجميد العينة. وينبغي أكتوبر مجمدة تماما. عند هذه النقطة يمكن أن تكون مخزنة في كتل -70 درجة مئوية ، لمدة سنة على الأقل.
3. Cryosectioning تقنيات
- إزالة كتلة المجمدة من -70 درجة مئوية ، وذلك يوم ناظم البرد تبريد سابقا في درجة حرارة تتراوح بين -18 و -21 درجة مئوية.
مذكرة (!) : درجات الحرارة خارج هذا النطاق قد يسبب متاعب مثل المقاطع الشباك ، وذوبان أو تصدع. - فصل أكتوبر كتلة من العفن ووضعه في دعم ناظم البرد عن طريق إضافة المزيد من أكتوبر
- من المهم توجيه كتلة بشكل صحيح ومحاذاته موازية للحافة شفرة.
مذكرة (!) : كما EBS هي أصغر من عينات الأنسجة الأخرى ، وهذه الخطوة هي في غاية الأهمية للتقليل من الخسائر المادية. - وينبغي أن يكون مقطوع كتل أكتوبر سطحي حتى يتم الحصول على سطح الطائرة. يجب أن تؤخذ الشرائح الرقيقة (10μm) من عينة الأنسجة والتي شنت على الشرائح الزجاجية المطلية سابقا مع 200 ملغ / مل بولي L يسين (10 ميكرولتر لكل شريحة) 9،10.
مذكرة (!) : لتجنب المقاطع torned الالتفات الى أية أضرار على النصل. - وينبغي أن تكون جميع أبواب الهواء المجفف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم يتم استخدامها أو تخزينها في -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة سهلة لمتابعة بروتوكول للحصول على أبواب ثابتة PFA ناظم البرد رقيقة من الهيئات مضغي الشكل مفيدة للالمناعي والمقايسات التهجين الموقع. وcryosections الناتجة تسمح بدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية التمايز ، مع الحفاظ على هيكلها وتنظيمها والمجاميع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل قرينتها دي أمبارو a Pesquisa تفعل استادو دو ريو دي جانيرو (FAPERJ) ، ناسيونال دي Conselho Desenvolvimento Científico تكنولوجيكو ه (CNPq) والمعهد الوطني للبحوث والتكنولوجيا Ciência ه (INCTC). ونحن ممتنون لبرونا S. M. بولسن وألين فرنانديز للصور EB.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
