Summary
Pluripotente stamcellen in suspensie te groeien differentiëren in embryoid organen (EBS). Hier laten we zien hoe een hoge kwaliteit EB vriescoupes handig voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire aspecten van de embryogenese te verkrijgen, met behoud van hun organisatie als aggregaten.
Abstract
Embryonale stamcellen (ES)-cellen zijn pluripotent cellen, afkomstig van de binnenste celmassa van de blastocyst-stadium vroege zoogdieren embryo's 1. Een cruciale fase in de differentiatie van embryonale stamcellen is de vorming van embryoid organen (EBS) aggregaten 2, 3. EB vorming is gebaseerd op spontane aggregatie bij ES-cellen worden gekweekt in niet-aanhanger platen. Drie-dimensionale EB recapituleert vele aspecten van de vroege zoogdieren embryogenese en differentiëren tot de drie kiembladen: ectoderm, mesoderm en endoderm 4.
Immunofluorescentie en in situ hybridisatie worden op grote schaal gebruikt technieken voor de detectie van target eiwitten en mRNA in cellen van een weefsel sectie 5, 6, 7. Hier presenteren wij een eenvoudige techniek om een hoge kwaliteit vriescoupes van embryoid lichamen te genereren. Deze aanpak is gebaseerd op de ruimtelijke oriëntatie van de EB inbedding in oktober gevolgd door de cryosection techniek. De resulterende secties kunnen worden onderworpen aan een breed scala aan analytische procedures om populaties van cellen die bepaalde eiwitten, RNA of DNA te karakteriseren. In die zin is de voorbereiding van de EB vriescoupes (10μm) zijn essentiële hulpmiddelen voor histologie vlekken analyse (bijvoorbeeld Hematoxilin en eosine, DAPI), immunofluorescentie (bijv. Oct4, Nestin) of in situ hybridisatie. Deze techniek kan ook helpen om aspecten van de embryogenese met betrekking begrijpen het onderhoud van de driedimensionale bolvormige structuur van de EBS.
Protocol
1. Fixatie en Cryopreservatie
Pluripotente stamcellen werden gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) geïnactiveerd met mitomycine C en onderhouden DMEM/F12 aangevuld met 20% knock-out serum vervanging (KSR) en 8ng / mL van fibroblast groeifactor (FGF-2). Met het oog op de vorming EB veroorzaken H9 cellen werden overgebracht naar niet-klevende gerechten en gekweekt gedurende 7 dagen, gehandhaafd in DMEM/F12 aangevuld met 15% KSR 8.
Let op (!): Deze techniek kan gebruikt worden voor EBS afgeleid is van een embryonaal en geïnduceerde pluripotente stamcellen.
- Verzamel de EBS uit de cultuur schotel met een pipet.
- Overdracht EBS om een 15 ml conische buis en wacht tot het materiaal zinkt naar de bodem van de buis.
- Verwijder de medium en vast EBS met een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Let op (!): Voor de in situ hybridisatie antigeen herstel moet worden gedaan om over te steken koppelen reactie met antilichamen te wijten aan het gebruik van de PFA 6,7 voorkomen. - Verwijder de PFA-oplossing en wassen met PBS gedurende 5 minuten.
- EBS moeten worden geplaatst in seriële verdunning van de PBS-gebufferde sucrose oplossingen (10, 20 en 30%, in volgorde) bij 25-28 ° C, elke oplossing moet worden vervangen om de 30 minuten. Het materiaal kan dan worden opgeslagen in de 30% sucrose oplossing bij 4 ° C tot aan de inbedding stap met oktober
2. Tissue Inbedding, Oriëntatie-en Freezing
- Zorgvuldig verzamelen EBS uit de tube. Ontlading zo veel sucrose-oplossing mogelijk te maken.
Let op (!): Het is belangrijk om de interne wand van de tip met sucrose oplossing nat voor het verzamelen van de EBS. Deze procedure kan voorkomen dat EB moet worden gehecht aan de tip. - Plaats EBS in de mal en verwijder de resterende sucrose-oplossing met filtreerpapier.
Let op (!): Het is belangrijk niet om de mal te vullen met EBS overlappingen te vermijden. - Vul de vorm met oktober langzaam, waarbij zorg niet opnieuw te schorten EBS. Daarna, plaats alle EB in het centrum van de mal en verwijder bellen met de pipet.
- Mild roeren gedurende 15 minuten.
- Omringen de mal met gebroken droog ijs om het monster te bevriezen. Oktober moet volledig worden bevroren. Op dit punt blokken kunnen worden bewaard bij -70 ° C, gedurende ten minste een jaar.
3. Cryosectioning Techniek
- Haal de bevroren blok van -70 ° C en leg ze op cryostat eerder gekoeld bij een temperatuur tussen de -18 en -21 ° C.
Let op (!): Temperaturen buiten dit bereik kan leiden tot problemen zoals delen curling, smelten of barsten. - Los de LGO blok uit de mal en plaats deze in de cryostaat te ondersteunen door het toevoegen van meer oktober
- Het is belangrijk te oriënteren het blok goed en lijn het parallel aan de rand van het blad.
Let op (!): Als EBS zijn kleiner dan andere weefselmonsters, deze stap is uiterst belangrijk om een minimum te beperken verlies van materiaal. - Oktober blokken te oppervlakkig worden coupes tot het oppervlak vlak is verkregen. Dunne secties (10μm) van het weefsel monster moet worden genomen en gemonteerd op glas dia's die eerder bekleed met 200 mg / ml poly L lysine (10 pi per slide) 9,10.
Let op (!): Om torned secties te vermijden aandacht te besteden aan eventuele schade aan het blad. - Alle secties moeten lucht gedroogd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens worden gebruikt of worden bewaard bij -70 ° C tot gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode biedt een eenvoudig te volgen protocol om PFA vaste dunne cryostaatcoupes van embryoid lichamen nuttig voor immunofluorescentie en in situ hybridisatie assays te verkrijgen. De resulterende vriescoupes toestaan dat de studie van de cellulaire en moleculaire aspecten van menselijke embryonale stamcellen differentiatie, met behoud van hun structuur en organisatie als aggregaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Fundação de Amparo een Geavanceerd do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) en Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). We zijn dankbaar dat Bruna S. Paulsen en Aline M. Fernandes voor de EB beelden.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
