Summary
Les cellules souches pluripotentes croissante en suspension se différencier en corps embryoïdes (EBS). Ici, nous montrons comment obtenir de haute qualité cryocoupes EB utile pour étudier les aspects cellulaires et moléculaires de l'embryogenèse, tout en préservant leur organisation en tant que granulats.
Abstract
Les cellules souches embryonnaires (ES) sont des cellules pluripotentes dérivées de la masse cellulaire interne de blastocyste-stade précoce des embryons de mammifères 1. Une étape cruciale dans la différenciation des cellules ES est la formation de corps embryoïdes (EB) des agrégats 2, 3. La formation EB est basée sur l'agrégation spontanée lorsque les cellules ES sont cultivées en plaques non adhérentes. Récapitule EB tridimensionnelle de nombreux aspects de l'embryogenèse chez les mammifères début et se différencient en trois feuillets embryonnaires: ectoderme, mésoderme et endoderme 4.
Immunofluorescence et hybridation in situ sont largement utilisés des techniques pour la détection des protéines cibles et de l'ARNm dans les cellules d'une section de 5 tissus, 6, 7. Nous présentons ici une technique simple pour générer cryocoupes haute qualité de corps embryoïdes. Cette approche repose sur l'orientation spatiale d'intégrer EB en OCT suivie par la technique cryosection. Les sections qui en résulte peut être soumis à une grande variété de procédures analytiques afin de caractériser les populations de cellules contenant certaines protéines, ARN ou ADN. En ce sens, la préparation de cryocoupes EB (10 microns) sont des outils essentiels pour l'analyse histologique coloration (par exemple hématoxiline et l'éosine, DAPI), l'immunofluorescence (par exemple Oct4, nestine) ou l'hybridation in situ. Cette technique peut aussi aider à comprendre les aspects de l'embryogenèse à l'égard du maintien de la structure tri-dimensionnelle sphériques d'EBS.
Protocol
1. Fixation et cryoconservation
Les cellules souches pluripotentes ont été cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) inactivé à la mitomycine C et maintenus en DMEM/F12 complété par le remplacement KO 20% de sérum (KSR) et 8ng / mL de facteur de croissance des fibroblastes (FGF-2). Afin d'induire la formation de cellules H9 EB ont été transférés à des non-adhérents plats et cultivées pendant 7 jours, maintenus dans DMEM/F12 supplémenté avec 15% KSR 8.
Note (!): Cette technique peut être utilisée pour EBS provenant de toute cellule souche embryonnaires pluripotentes et induits.
- Recueillir l'EBS de la boîte de culture avec une pipette.
- Transfert EBS pour un tube de 15 ml conique et attendre jusqu'à ce que le matériel tombe au fond du tube.
- Retirer moyennes et fixer EBS avec une paraformaldéhyde à 4% (PFA) solution dans du PBS pendant 30 minutes à température ambiante.
Note (!): Pour la récupération hybridation in situ d'antigène doit être fait afin d'éviter une réaction croisée avec des anticorps lien en raison de l'utilisation de la PFA 6,7. - Retirer solution de PFA et laver avec du PBS pendant 5 min.
- EB doit être placée dans de dilution en série de PBS tamponné solutions de saccharose (10, 20 et 30%, dans l'ordre) à 25-28 ° C, chaque solution doit être remplacée toutes les 30 min. Le matériau peut ensuite être stocké dans la solution de saccharose 30% à 4 ° C jusqu'à ce que l'étape d'enrobage avec octobre
2. Enrobage des tissus, d'orientation et de congélation
- Recueillir soigneusement l'EBS du tube. Solution de saccharose à décharge, autant que possible.
Note (!): Il est important de mouiller la paroi interne de la pointe avec une solution de saccharose avant de recueillir l'EBS. Cette procédure permet d'éviter EB à joindre à la pointe. - Placez EB dans le moule et retirer la solution de saccharose restant avec du papier filtre.
Note (!): Il est important de ne pas remplir le moule avec EBS pour éviter les chevauchements. - Remplir le moule avec octobre lentement, en prenant soin de ne pas remettre en suspension EBS. Après cela, placez tous EB au centre du moule et retirer les bulles avec la pipette.
- Légèrement agiter pendant 15 minutes.
- Entourez le moule avec la glace sèche écrasée de geler l'échantillon. Octobre devrait être complètement gelé. A ce point blocs peuvent être conservés à -70 ° C, pendant au moins un an.
3. Cryosectioning Technique
- Retirez le bloc congelé de -70 ° C et les placer sur cryostat préalablement refroidi à une température comprise entre -18 et -21 ° C.
Note (!): Températures en dehors de cette plage peut provoquer des troubles comme les sections de curling, de fusion ou de fissuration. - Détachez le bloc PTOM de la moisissure et la placer dans le support en ajoutant plus de cryostat octobre
- Il est important d'orienter correctement et le bloc de l'aligner parallèlement au bord de la lame.
Note (!): Comme EBS sont plus petites que d'autres échantillons de tissu, cette étape est extrêmement importante pour minimiser la perte de matériel. - Blocs octobre doit être sectionnée superficiellement jusqu'à ce que le plan de la surface est obtenue. Les lames minces (10 microns) de l'échantillon de tissu doivent être prises et montées sur lames de verre préalablement enduite avec 200 mg / ml de poly L lysine (10 uL par diapositive) 9,10.
Note (!): Pour éviter sections torned attention à tout dommage à la lame. - Toutes les sections doivent être séchés à l'air pendant 1 heure à température ambiante et ensuite être utilisés ou stockés à -70 ° C jusqu'à utilisation.
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Discussion
La méthode décrite ici fournit un facile à suivre le protocole pour obtenir PFA fixes sections de cryostat mince de corps embryoïdes utiles pour l'immunofluorescence et dans des essais d'hybridation in situ. Le cryocoupes résultant permettre l'étude des aspects cellulaires et moléculaires de cellules souches humaines différenciation embryonnaire, tout en préservant leur structure et leur organisation en tant que granulats.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fundação de Amparo une Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico e Científico (CNPq) et l'Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia (INCTC). Nous sommes reconnaissants à S. Paulsen Bruna et Aline M. Fernandes pour les images EB.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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