Summary
정지 성장 Pluripotent 줄기 세포가 embryoid기구 (EBS)에 구별. 집합체로 조직을 보존하면서 여기에서 우리는 embryogenesis의 세포 및 분자 측면을 연구하는 데 유용 고품질 EB의 cryosections를 얻는 방법을 보여줍니다.
Abstract
배아 줄기 (ES) 세포가 blastocyst 단계 초기 포유류의 배아 1의 내부 세포 덩어리에서 파생된 pluripotent 세포 수 있습니다. ES 세포의 분화에 중요한 단계는 embryoid 기관의 형성 (EBS) 집계 2, 3입니다. ES 세포가 아닌 자기편 접시에서 양식 때 EB의 형성은 자연 집합을 기반으로합니다. ectoderm, mesoderm 및 endoderm 4 : 입체 EB의 recapitulates 많은 초기 포유류의 embryogenesis의 측면 및 세 세균 층에 구별.
Immunofluorescence 및 현장 하이브리드화에 널리 조직 제 5, 6, 7 세포에있는 목표 단백질 및 mRNA의 검출 기술을 사용합니다. 여기 embryoid 기관의 고품질 cryosections를 생성하는 간단한 기술을 제시한다. 이러한 접근 방식은 OCT에서 EB의 포함의 공간적 방향 cryosection 기술 다음에 의존합니다. 그 결과 섹션은 특정 단백질, RNA 또는 DNA를 포함한 세포의 인구를 특성화하기 위해 분석 절차의 다양한 받게 수 있습니다. 이러한 의미에서, EB cryosections의 준비 (10μm)은 조직학 얼룩의 분석을위한 필수 도구 (예 : Hematoxilin과 Eosin, DAPI), immunofluorescence (예 : Oct4, nestin) 또는 현장 하이브리드화에 있습니다. 이 기술은 또한 EBS의 트라이 차원 구면 구조의 유지 보수 관련하여 embryogenesis의 측면을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
1. 고정 및 Cryopreservation
Pluripotent 줄기 세포는 fibroblast의 성장 인자의 20 % 녹아웃 혈청 대체 (KSR) 및 8ng / ML (FGF - 2)와 보충 mitomycin C와 inactivated과 DMEM/F12 유지 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEF)에 교양되었습니다. EB 형성을 유도하기 위해서는 H9 세포가 아닌 자기편 요리로 전송 15 % KSR 8 보충 DMEM/F12 유지 칠일에 대한 교양되었습니다.
참고 (!) :이 기술은 모든 배아 및 유도 pluripotent 줄기 세포에서 파생된 EBS 사용할 수 있습니다.
- 피펫과 문화 요리에서 EBS를 수집합니다.
- 재료 튜브의 바닥에 싱크까지 전송 15 ML 원뿔 관에 EBS하고 기다립니다.
- 미디어를 제거하고 실온에서 30 분간 PBS에서 4 % paraformaldehyde (PFA) 솔루션과 EBS를 수정.
참고 (!) : 현장 하이브리드화 항원 복구에 들어 PFA 6,7의 사용으로 인해 항체와 교차 연결 반응을 방지하기 위해 수행되어야합니다. - PFA 솔루션을 제거하고 5 분 PBS로 세척.
- EBS는 25-28에서 PBS 버퍼 자당 솔루션의 시리얼 희석 (순서대로 10, 20, 30 %)에 배치되어야 ° C, 각 솔루션은 매 30 분 교체해야합니다. 자료는 다음 OCT로 퍼가기 단계까지 4 30 % 자당 용액 ° C에 갖춰져 수 있습니다.
2. 조직 퍼가기,지도 및 냉동
- 조심스럽게 튜브에서 EBS를 수집합니다. 가능한 한 배출 많이 자당 솔루션입니다.
참고 (!) : EBS를 수집하기 전에 자당 솔루션 팁의 내부 벽에 싸하는 것이 중요합니다. 이 절차는 제보에 첨부된 수 EB를 피할 수 있습니다. - 금형에 EBS를 삽입 및 필터 종이에 남아있는 자당 솔루션을 제거합니다.
참고 (!) : 중복 피하기 위해 EBS와 금형을 기입하지 않는 것이 중요합니다. - EBS를 다시 정지하지 돌보는 천천히 OCT와 금형을 입력합니다. 그 후, 금형의 중심에 모두 EB를 놓고 피펫과 거품을 제거합니다.
- 가벼운 15 분 동안 선동.
- 예제를 동결하는 조각 드라이 아이스와 금형을 포위하라. OCT 완전히 얼어해야합니다. 이 시점에서 블록은 하나 이상의 년, -70 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. 기술 Cryosectioning
- -70에서 냉동 블록을 제거 이전에 -18과 -21 사이의 온도에서 냉각 그라 이오 스탯에 대한 ° C 및 장소 ° C.
참고 (!)이 범위 밖의 온도가 부분과 같은 문제가 컬링 용융 또는 균열이 발생할 수 있습니다. - 금형에서 OCT 블록을 분리보다 OCT를 추가하여 그라 이오 스탯 지원에 넣습니다.
- 그것은 제대로 방향 블록을하는 것이 중요하며 칼날의 가장자리에 병렬 정렬합니다.
참고 (!) : EBS 다른 조직 샘플보다 작은 있기 때문에,이 단계는 자료의 손실을 최소화하기 위해 매우 중요합니다. - 표면 비행기를 얻을 때까지 OCT 블록 피상적으로 sectioned해야합니다. 조직 표본의 얇은 부분 (10μm)은 이전에 200 MG / ML 폴리 리신 L (슬라이드 당 10 μL) 9,10와 코팅 슬라이드 촬영과 유리에 장착해야합니다.
참고 (!) : torned 섹션을 방지하려면 블레이드에서하는 어떠한 손해에주의를 기울이십시오. - 모든 섹션이 있어야 공기 건조 상온에서 1 시간 후 사용하기 전까지 사용하거나 -70 ° C에 저장된을 수 있습니다.
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Discussion
방법은 여기에 설명된 것은 제공하는 쉬운 따라 immunofluorescence 및 현장 하이브리드화 assays에 유용 embryoid 기관의 PFA 고정 얇은 그라 이오 스탯 섹션을 얻기 위해 프로토콜을. 집합체로서의 구조와 조직을 보존하면서 결과 cryosections은 인간 배아 줄기 세포의 분화의 세포 및 분자 측면의 연구를 허용합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 Fundação 드 Amparo에 의해 지원되었다 Pesquisa 에스타도하나요 리우데 자네이루 (FAPERJ), Conselho 나셔널 드 Desenvolvimento Científico 전자 Tecnológico (CNPq)과 Instituto 나셔널 드 Ciência E Tecnologia (INCTC). 우리는 브루나 S. 폴슨과 EB의 이미지 앨린 M. 페르난데스에게 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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