Summary
Pluripotenta stamceller växer i suspension differentieras till embryoid organ (EBS). Här visar vi hur du får hög kryosnitt kvalitet EB användbart för att studera cellulära och molekylära aspekter av embryogenes, samtidigt som deras organisation som aggregat.
Abstract
Embryonala stamceller (ES-celler) är pluripotenta celler som härrör från den inre cellmassan i blastocysten steg tidiga däggdjur embryon 1. En avgörande fas i differentiering av ES-celler är bildandet av embryoid organ (EBS) aggregat 2, 3. EB formation är baserad på spontana aggregering när ES-celler odlas i icke vidhäftande plattor. Tredimensionella EB rekapitulerar många aspekter av tidiga däggdjur embryogenesen och differentierar till de tre groddblad: ektoderm, mesoderm och endoderm 4.
Immunofluorescens och in situ hybridisering används ofta tekniker för att upptäcka målproteiner och mRNA som finns i celler i en vävnad avsnitt 5, 6, 7. Här presenterar vi en enkel teknik för att generera hög kvalitet kryosnitt av embryoid organ. Detta synsätt bygger på rumslig orientering EB ingjutning i oktober följt av cryosection teknik. Den resulterande delarna kan utsättas för en mängd olika analysmetoder för att karaktärisera populationer av celler som innehåller vissa proteiner, RNA eller DNA. I denna mening, beredning av EB kryosnitt (10μm) är viktiga verktyg för histologi färgning analys (t.ex. Hematoxilin och Eosin, DAPI), immunofluorescens (t.ex. Oct4, nestin) eller in situ hybridisering. Denna teknik kan också hjälpa till att förstå aspekter av embryogenesen med avseende på underhållet av det tredimensionella sfäriska struktur EBS.
Protocol
1. Fixering och Frysförvaring
Pluripotenta stamceller odlades på möss embryonala fibroblaster (MEF) inaktiveras med mitomycin C och underhållas i DMEM/F12 kompletterad med 20% knockout serum ersättare (KSR) och 8ng / mL fibroblast tillväxtfaktor (FGF-2). För att förmå EB bildandet H9 celler överfördes till icke-häftande rätter och odlade i 7 dagar, upprätthålls i DMEM/F12 kompletterad med 15% KSR 8.
Anmärkning (!): Denna teknik kan användas för EBS härrör från något av embryonala och inducerade pluripotenta stamceller.
- Samla EBS från kulturen skålen med en pipett.
- Överför EBS ett 15 ml koniskt rör och vänta tills materialet sjunker till botten av röret.
- Ta bort medium och fixa EBS med en 4% paraformaldehyd (PFA) lösning i PBS i 30 minuter i rumstemperatur.
Anmärkning (!): För in situ hybridisering antigen återhämtning bör göras för att undvika att korsa länka reaktion med antikroppar på grund av användningen av PFA 6,7. - Ta bort PFA-lösning och tvätta med PBS i 5 min.
- EB ska placeras i serie utspädning av PBS buffrad-sackaros lösningar (10, 20 och 30%, i följd) vid 25-28 ° C, måste varje lösning bytas var 30 min. Materialet kan sedan lagras i 30% sackaroslösning vid 4 ° C tills inbäddning steg med oktober
2. Tissue Bädda, utvecklings-och frysning
- Försiktigt samla EBS från röret. Utsläpp så mycket sackaroslösning som möjligt.
Anmärkning (!): Det är viktigt att våt innervägg spetsen med sackaros lösning innan insamlingen av EBS. Detta förfarande kan undvika EB som skall knytas till spetsen. - Placera EB i formen och ta bort återstående sackaroslösning med filtrerpapper.
Anmärkning (!): Det är viktigt att inte fylla formen med EBS att undvika överlappning. - Fyll formen med oktober långsamt, noga med att inte återsuspendera EBS. Efter det, placera alla EB i mitten av formen och ta bort bubblor med pipetten.
- Svagt agitera i 15 minuter.
- Surround formen med krossad torris att frysa provet. Oktober bör vara helt frysta. Vid denna punkt block kan lagras vid -70 ° C under minst ett år.
3. Cryosectioning Teknik
- Ta ut den frusna kvarter från -70 ° C och lägg på kryostat tidigare svalnat vid en temperatur mellan -18 och -21 ° C.
Anmärkning (!): Temperaturer utanför detta intervall kan orsaka problem som delar curling, smältning eller sprickbildning. - Lossa oktober kvarter från formen och placera den i kryostat stöd genom att lägga till fler oktober
- Det är viktigt att orientera blocket ordentligt och anpassa den parallell med kanten av bladet.
Anmärkning (!): Som EB är mindre än andra vävnadsprover, är detta steg oerhört viktigt att minimera förlust av material. - Oktober block bör sektioneras ytligt tills ytan planet erhålls. Tunna sektioner (10μm) av vävnadsprov skall tas och monteras på objektglas som tidigare belagd med 200 mg / ml poly L lysin (10 mikroliter per bild) 9,10.
Anmärkning (!): För att undvika torned sektioner uppmärksamma eventuella skador på bladet. - Alla sektioner ska lufttorkas i 1 timme i rumstemperatur och sedan användas eller lagras vid -70 ° C fram till användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här ger en enkel att följa protokollet för att få PFA fast tunna kryostatsnitt av embryoid organ användbar för immunofluorescens och in situ hybridisering analyser. Den resulterande kryosnitt tillåter studier av cellulära och molekylära aspekter av mänskliga embryonala stamceller differentiering, samtidigt som deras struktur och organisation som aggregat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Fundação de Amparo en Pesquisa gör Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) och Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia (INCTC). Vi är tacksamma för Bruna S. Paulsen och Aline M. Fernandes för EB bilder.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
