Summary
Pluripotent kök hücreleri süspansiyon büyüyen embriyoid organları (EBS) farklılaşırlar. Agrega olarak organizasyon korurken, embriyogenez hücresel ve moleküler yönlerini çalışmak için yararlıdır, yüksek kaliteli EB cryosections elde etmek için nasıl göstermek.
Abstract
Embriyonik kök (ES) hücreleri blastosist aşamasındaki erken memeli embriyolarının 1 iç hücre kütlesinden elde edilen pluripotent hücreler. ES hücrelerinin farklılaşmasında önemli bir aşama embriyoid organlarının oluşumu (EBS), 2, 3 agrega. ES hücrelerinin yapışık olmayan plakalar kültüre EB oluşumu spontan agregasyonu üzerine dayanır. Ektoderm, mezoderm ve endoderm 4: Üç boyutlu EB özetlediği çok erken memeli embriyogenez yönlerini ve üç germ farklılaşırlar.
İmmünofloresan ve in situ hibridizasyon yaygın bir doku bölüm 5, 6, 7 hücreleri hedef alan protein ve mRNA algılama teknikleri kullanılır. Burada embriyoid organlarının yüksek kaliteli cryosections oluşturmak için basit bir yöntem mevcut. Bu yaklaşım, OCT EB gömme mekansal yönelim cryosection tekniği ile takip dayanmaktadır. Ortaya çıkan bölümlerde, bazı proteinler, RNA veya DNA içeren hücreler popülasyonları için analitik yöntemler geniş bir yelpazede tabi tutulabilir. Bu anlamda, EB cryosections hazırlama (10μm) histoloji boyama analizi için gerekli araçları (örneğin Hematoxilin ve Eosin, DAPI), immünofloresan (örneğin Oct4, nestin) veya in situ hibridizasyon. Bu teknik aynı zamanda, EBS, üç boyutlu küresel yapısı bakım açısından embriyogenez yönlerini anlamak için yardımcı olabilir.
Protocol
1. Fiksasyon ve Kriyoprezervasyon
Pluripotent kök hücreleri, fare embriyonik fibroblast büyüme faktörü% 20 nakavt serum replasmanı (KSR) ve 8ng / ml (FGF-2) ile takviye mitomisin C ile inaktive edilmiş ve bakımı, DMEM/F12 içinde fibroblastlar (MEF) üzerine kültüre edildi. EB oluşumunu uyarmak için H9 hücreleri yapışmaz yemekleri, 7 gün,% 15 KSR 8 ile desteklenmiş DMEM/F12 muhafaza transfer ve kültüre edildi .
Not (!): Bu teknik, herhangi bir embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücreden elde edilen EBS için kullanılabilir.
- Bir pipet yardımıyla kültür çanak EBS toplayın.
- Transferi 15 ml konik tüp EBS ve malzeme tüpün dibine lavabolar kadar bekleyin.
- Orta çıkartın ve oda sıcaklığında 30 dakika süreyle PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) çözümü ile EBS düzeltmek.
Not (!): In situ hibridizasyon antijen kurtarma için PFA 6,7 kullanımı nedeniyle antikorları ile çapraz link reaksiyonu önlemek için yapılmalıdır. - PFA çözüm çıkarın ve 5 dakika PBS ile yıkayın.
- EBS 25-28 PBS-buffered sakaroz çözümleri seri seyreltme (sırayla 10, 20 ve% 30) yer olmalıdır ° C, her çözüm, her 30 dakikada bir değiştirilmesi gerekir. Daha sonra malzeme OCT ile gömme adım kadar 4% 30 sakaroz çözeltisini ° C stoklanmayacaktır.
2. Doku Gömme, Rehberlik ve Donma
- Tüp dikkatlice EBS toplamak. Discharge mümkün olduğu kadar çok sakaroz çözeltisini.
Not (!): EBS toplama önce, sukroz solüsyonu ile ucu iç duvar ıslak önemlidir. Bu prosedür ucuna eklenecek EB önleyebilirsiniz. - EBS kalıp koyun ve filtre kağıdı ile Sakkarat çözüm kaldırmak.
Not (!): EBS ile örtüşen önlemek için kalıp doldurmak için önemlidir. - EBS yeniden askıya almaya özen kalıp, yavaş yavaş OCT ile doldurun. Bundan sonra, kalıp merkezinde tüm EB ve pipet ile kabarcıkları giderin.
- 15 dakika için hafif ajitasyon.
- Örnek dondurmak için ezilmiş kuru buz ile kalıp çevreleyin. Ekim tamamen dondurulmuş olmalıdır. Bu noktada blok en az bir yıl için, -70 ° C'de saklanan olabilir.
3. Tekniği Cryosectioning
- -70 -18 Ve -21 arasında bir sıcaklıkta soğutulan Kriyostat ° C ve yer donmuş blok çıkarın ° C
Not (!): Bu aralığın dışında sıcaklıklar bölümler gibi sıkıntılar, kıvrık, eritme veya çatlamalara neden olabilir. - OCT bloğu kalıptan çıkarın ve daha Ekim ekleyerek Kriyostat destek içine yerleştirin.
- Şark düzgün blok için önemli olduğunu ve bıçak kenarına paralel hizalamak.
Not (!): EBS diğer doku örnekleri daha küçük olduğundan, bu adım, malzeme kaybı en aza indirmek için son derece önemlidir. - Ekim blokları, yüzey düzlemi elde edilinceye kadar yüzeysel kesitli olmalıdır. İnce bölümler (10μm) doku örneği alınır ve daha önce 200 mg / ml poli L lisin (slayt başına 10 mcL) 9,10 ile kaplı slaytlar cam monte gerekir .
Not (!): Torned bölümleri önlemek için herhangi bir hasar bıçak dikkat. - Tüm bölümler olmalıdır Hava-kurutulur ve oda sıcaklığında 1 saat sonra kullanıma kadar kullanılan veya -70 ° C'de saklanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan yöntem sağlayan bir kolay takip PFA sabit ince Kriyostat bölümleri immünofloresan ve in situ hibridizasyon deneyleri yararlı embriyoid organları almak için protokol . Agrega olarak kendi yapısı ve organizasyonu koruyarak çıkan cryosections, insan embriyonik kök hücreleri farklılaşma hücresel ve moleküler yönlerini çalışma izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Fundação de Amparo tarafından desteklenen bir Pesquisa Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ve Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia (INCTC). Bruna S. Paulsen ve Aline M. Fernandes EB görüntüler için minnettarız.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura Finetek | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | Techno Plastic Products | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
- Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
- Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
- Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
- Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
- Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
- Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).
