Summary
Мы предоставляем шаг за шагом протокол для цельноклеточной патч зажим записи кальция Release-активированный кальций (CRAC) токов в периферической крови мононуклеарных клеток происхождения человека Т-лимфоцитов.
Abstract
В Т-лимфоциты, истощение Са 2 + из внутриклеточных Са 2 + магазине приводит к активации plasmalemmal Ca 2 + каналы, называемые Кальций Release-активированный кальций (CRAC) каналов. CRAC каналы играют важную роль в регуляции клеточной пролиферации Т и экспрессии генов. Аномальные канал CRAC функции Т-клеток была связана с тяжелым комбинированным иммунодефицитом и аутоиммунных заболеваний, 1, 2. Изучение CRAC функцию канала в человеческих Т-клеток может раскрыть новые молекулярные механизмы, регулирующие нормальный иммунный ответ и раскрыть причины человека, связанных с заболеваниями. Электрофизиологические записи мембранных токов обеспечивают наиболее точную оценку функциональных свойств канала и их регулирование. Электрофизиологические оценки CRAC токов канала в Jurkat Т-клетки, лейкемии человека Т-клеток линии, была впервые исполнена более чем 20 лет назад 3, однако, CRAC измерения тока в нормальных человеческих Т-клеток остается сложной задачей. Трудности в записи токов CRAC канала в нормальных клетках Т усугубляется тем, что кровь полученных Т-лимфоцитов значительно меньше по размеру, чем Jurkat Т-клеток и, таким образом, эндогенные цельноклеточная токов CRAC очень низкие по амплитуде. Здесь мы даем шаг за шагом процедуры, которые мы обычно используем для записи Са 2 + и Na + токи через CRAC каналов в состоянии покоя человека Т-клеток выделенных из периферической крови здоровых добровольцев. Метод, описанный здесь, был принят от процедур, используемых для записи CRAC токов в Jurkat Т-клеток и активированных Т-клетках человека 4-8.
Protocol
1. Подготовка Отдых правам Т-лимфоцитов
- Использование RosetteSep правам Т-клеток Коктейль по обогащению и среднего RosetteSep Плотность, очистить Т-клеток из человеческих образцов крови в соответствии с инструкциями производителя. В результате клеточной популяции должна содержать 95% CD3 + Т-клеток отдыха. Мы очищаем человека Т-лимфоцитов из периферической крови собранных от здоровых добровольцев в соответствии с протоколом, утвержденным Советом UC Davis Внутренняя проверка.
- После изоляции, ресуспендируют отдыха Т-клеток при плотности 0,5 х 10 6 клеток / мл в ячейку культуральной среде, содержащей RPMI-1640 с глютамином и HEPES, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2% GlutaMAX-I, 1% RPMI 1640 витамин решение, 1% RPMI 1640 аминокислоты решение кислоты, 1% пируват натрия и 0,03% β-меркаптоэтанола.
- Место клеточной суспензии во флаконы культуре клеток и поддерживать при температуре 37 ° С в увлажненной инкубаторе с 5% CO 2 в течение 24 ч до эксперимента.
2. Подготовка Запись палаты
- Ниже приведены необходимые для подготовки записи камер:) кремния уплотнительные кольца, б) круглое, 25-мм покровные очищать 70% этилового спирта и дистиллированной H 2 O, в) смешанные Sylgard184, подготовленный в соответствии с инструкциями производителя, и г) два 60 х 15 мм чашки Петри.
- Место ~ 0,5 мл смешанного Sylgard184 в 60x15 мм чашки Петри.
- Опустите нижнюю часть О-кольцо в Sylgard184 использованием щипцов.
- Удалите излишки Sylgard184 от края уплотнительного кольца путем размещения уплотнительного кольца на чистую поверхность, например, другой чашке Петри.
- Место кольцо на покровное и нажмите на нее вниз.
- Cure Sylgard184 при нагревании камеры при 85 ° С в течение 40-60 минут или до Sylgard184 полимеризуется.
- Храните записи камер в пыли контейнер.
3. Подготовка Патч Пипетки
- В день эксперимента, потяните пипетки с ~ 2 мкм, диаметр кончика использованием стеклянных капилляров и съемник пипетки. Мы используем боросиликатного трубка с нитью (диаметр: 1,5 мм и ID: 1,10 мм). Магазин пипетки в пыли месте.
- Пальто наконечники с Sylgard184 или HIPEC R6101 Semiconductor Защитные покрытия, согласно стандартной процедуре 9.
- Осторожно пожарные польский пипетки до эксперимента.
4. Патч зажим установки подготовки
- Настройка и сохранение макросов для gigaseal образования в программное обеспечение управления патч-зажим усилителя. Мы используем EPC-10 Усилитель поддерживает Windows XP и импульсный программного обеспечения для сбора данных. Мы устанавливаем "настройка", "по-клеток», и «цельноклеточная" макросы в соответствии с EPC-10 ручных и использовать их для всех экспериментов.
- Подготовка ванны решений и пипетка Решения приведены в таблице 1 до эксперимента и хранить их при температуре 4 ° С не более 1 недели.
| Химические вещества | Ванна Solutions (мМ) | Внесите Solutions (мМ) | ||
| # 1 | # 2 | # 3 | ||
| CH 3 SO 3 Na | 130 | 110 | 125 | - |
| NaCl | 2 | 4 | 5 | - |
| Ca (OH) 2 | - | 20 | - | - |
| MgCl 2 | 3 | 1 | - | 5 |
| MgSO 4 | - | - | - | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| ЭДТА | - | - | 1 | - |
| Cs-spartate | - | - | - | 125 |
| BAPTA | - | - | - | 12 |
| Глюкоза | 10 | 10 | 10 | - |
Таблица 1. Решения для целых клеток в канцерогенности текущей записи.
Все химические вещества были приобретены у компании Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
- Определите жидкости потенциалов перехода (ЖЖ) между решением патч пипетки и каждой ванны решение 10. Сохранить значение LJ в нужном месте с помощью приобретения программного обеспечения. Например, в программе Импульсный вставки значения ЖЖ в "ЖЖ" контроля в "усилитель" окна.
- Настройка и сохранение протоколов стимуляции, как показано на рисунке 1, в соответствующем месте вашего приобретения программного обеспечения до экспериментов. В импульсной программы, мы устанавливаем приобретение протокол в «Пульс Поколение" окна.
Рисунок 1. . Стимуляция протокол напряжения рампы от -120 до +100 мВ 50 мс продолжительность применяется каждые 0,2 - 2 с (5 - 0,5 Гц). Холдинг потенциала (V ч) между рампами поддерживается на уровне +30 мВ.
5. Монтаж ячеек на столике микроскопа
- Пальто записи камер с поли-L-лизин в течение ~ 20 минут и промыть H 2 O, а затем с сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) перед покрытием клеток.
- Пластина 500 мкл клеточной суспензии, содержащей 0,2-0,5 x10 6 клеток в камере и инкубировать в течение 20 мин при 37 ° C.
- Безопасная запись камеры с прикрепленным клеток в камере держателя. Мы используем заказ камеру держателя, где базы для поддержания нижней части покровного стекла, а верхняя часть слегка прижимается к верхней части покровного стекла.
- Место камеры держатель на стадии инвертированного микроскопа.
- Сосредоточьтесь на клетки в проходящем свете. Мы используем 40х целью погружения на нефть.
- Место Ag / AgCl электрод в ванну.
- Совместите multibarrel, гравитация управляемой системы перфузии. Кончик трубки приток должен быть размещен на углом 45 ° к покровным близко к полю зрения.
- Поместите всасывающую трубку противоположной оконечности приток трубки.
- Заливать камеру с фосфатным буферным раствором (PBS) или HBSS, чтобы смыть культуры клеток и свободно прилагается клеток.
6. CRAC канала Токи Запись
- Найти ячейку, которая прочно прикреплены к покровным. Как правило, мы выбрать среднего размера, круглые клетки с гладкой внешней поверхностью.
- Заливать записи камеры с Са 2 +-бесплатно, 3 мМ Mg 2 +-содержащих ванны решение № 1 (Таблица 1), содержащая 0,5-1 мкМ thapsigargin в течение 8-10 мин для блокирования насоса SERCA. Мы выполняем этот шаг, чтобы истощать хранить до gigaseal образования.
- Использование Эппендорф microloader и П-20 смещение пипетки, заполните патч пипетки с решением пипетки (табл. 1) и вставьте патч пипетки в пипетку держатель на усилитель headstage. Са 2 + хелатором BAPTA включен в решение пипетку, чтобы пассивно разрушающих хранить и снизить Са 2 +-зависимые CRAC инактивации каналов.
- Нанесите небольшое количество положительного давления (~ 3 дюймов Н 2 О) внутри патча пипетки перед входом в ванну. Мы используем заказ напорно-всасывающие устройства, подключенного к сжатый воздух и вакуумные линии для создания положительного или отрицательного давления внутри патча пипетки.
- Нижняя патч пипетки в ванну под визуальным контролем через микроскоп. В "осциллограф" окно, вы должны увидеть ток, протекающий через пипетку. Ступенчатое изменение амплитуды тока должна быть вызвана небольшой импульс напряжения амплитудой (тестовый импульс), применяемых заданного макроса. В это время, вы должны быть в состоянии определить значение сопротивления пипетки. Сопротивления наших пипетки, как правило, 5-6 МОм.
- Правильная "смещение" потенциал, создаваемый между пипеткой и электрода сравнения.
- Под визуальным контролем через микроскоп, довести пипетки ближе к клетке, пока она не коснется клеточной мембраны.
- Применить отрицательного давления (20-40 дюймов Н 2 О) внутри патча пипетки.
- Монитор gigaseal образования в "осциллограф" окна. Вы увидите, амплитуда тока, индуцированного теста пульс, снижается и стоимость пипетки сопротивление возрастает до> 5 ГОм. Обычно gigaseal формы, в Feш секунд, но это может занять 1-2 мин для достижения стабильного gigaseal.
- Компенсировать емкость пипетки ("C-Fast").
- Перерыв патч мембраны с применением дополнительного отрицательного давления с помощью 20 мл шприца.
- Установить проведения потенциал до +30 мВ. Положительный потенциал холдинга помогает предотвратить кальций-зависимых каналов CRAC инактивации.
- Компенсировать мембраны емкость ячейки ("C-медленно"); сохранять или записывать значение C-медленно.
- Проверьте значение доступа сопротивления "Р С". В наших экспериментах, Р С, как правило, 7-20 МОм.
- Начать применять серию напряжения рампы с частотой 0,5 Гц (рис. 1) в Са 2 +-свободные 3 мМ Mg 2 +-содержащих ванны решение № 1. В этом решении, CRAC тока пренебрежимо мала по сравнению с "утечка" тока из-за плохой проницаемости CRAC каналов для Mg 2 +. Сохранение и использование текущей следы записан в ванной решение № 1 в будущем анализы, как «утечка» токов. Абсолютная амплитуда "утечка" тока при -100 мВ должна быть меньше или равна 5 мкА. Если ячейка "дырявые", остановить эксперимент и начать все заново с использованием новой пипеткой патч и новые клетки.
- Для записи Са 2 + ток по каналам CRAC (я Са-CRAC), заменить Са 2 +-свободные 3 мМ Mg 2 +-содержащих ванны решение № 1 с 20 мМ Са 2 +-содержащих ванны решение № 2 (табл. 1) за счет перехода перфузии клапанов. Это позволяет Са 2 + течь через CRAC каналов и производить внутренний ток. В "осциллограф" окно, вы увидите развитие внутренне исправления я Са-CRAC (рис. 2). Амплитуда тока при отрицательных напряжениях будет продолжать расти в течение приблизительно 1 мин из-за Са 2 +-зависимые потенцирование CRAC тока.
- Увеличение частоты стимуляции напряжением рампы до 5 Гц, которая необходима для записи переходных Na + ток через CRAC каналов.
- Замените 20 мМ Са 2 +-содержащих ванны решение № 2 с Na +-содержащие двухвалентных катионов без решения № 3 (табл. 1) за счет перехода перфузии клапанов. В "осциллограф" окна, вы увидите, переходные развитие большей амплитудой внутренне исправления Na + ток через каналы CRAC (я Na-CRAC; рис. 2).
- Можно применить 20 мМ Са 2 +-содержащие ванны решение # 2, содержащих 1-5 мкМ La 3 + в конце эксперимента для записи "утечка" тока. Тем не менее, мы не нашли такого подхода полезно, потому что "утечка" тока изменяется с течением времени и он может стать больше или меньше в конце эксперимента. Мы предпочитаем брать текущие записан в Са 2 +-свободные 3 мМ Mg 2 +-содержащих ванны решение № 1 в начале эксперимента как "утечка" тока.
- Сохранить записанные текущие следов для последующего анализа.
7. Анализ данных
- Получить сохранены текущие записи в программное обеспечение для анализа. Мы используем импульсный программы для анализа.
- Мера амплитуды тока в начале и в конце напряжения рампы. Мы обычно измеряют амплитуды тока при -100 мВ и на +100 мВ использованием пары курсоры в "осциллограф" окно Импульсный программы.
- Экспорт значения амплитуды тока в графической программе для дальнейшего анализа и графического представления. Мы используем Происхождение Научно графиков и программное обеспечение для анализа, версия 7.
8. Представитель Результаты
Рисунок 2. CRAC токов в отдыхают человека Т-клеток. (), Time ходе CRAC токи, записанные в цельноклеточной напряжения зажим конфигурации при -100 мВ (темные кружки) и +100 мВ (кружки). До gigaseal образование, клетки предварительно инкубировали в течение ~ 10 мин в Са 2 +-свободные 3 мМ Mg 2 +-содержащих ванны решение № 1, содержащий 0,5 мкМ thapsigargin. После взлома, ванна решения были последовательно применяются следующим образом: Ca 2 +-свободные 3 мМ Mg 2 +-содержащих ванны решение # 1 (0 + 3 Ca Mg), затем 20 мМ Са 2 +-содержащих ванны решение № 2 (20 Са), а затем двухвалентных катионов без ванны решение № 3 (DVF), затем ванна решение # 2 (20 Са). Ячейка стимулировали серию напряжения рампы, как показано на рисунке 1. Частота рампы составила 5 Гц в ванной решение № 3 (DVF) и 0,5 Гц во всех других решений. Обратите внимание на медленное развитие Я-Са CRAC после применения 20 мМ Са 2 +-содержащих ванны решение № 2 и быстрые переходные развитие Я Na-CRAC в DVF ванны решение № 3. (B), представитель текущей следы выявлены в ходе напряжение рампы в Са 2 +-свободные 3 мМ Mg 2 +-содержащих ванны решение № 1 ("Утечки"), 20 мМ Са 2 +-содержащих ванны решение # 2 (20 Ca), и ванной решение № 3 (DVF). (C, D), ток-напряжение отношений Я-Са CRAC (C), и я Na-CRAC (D), полученных путем вычитания "утечки" тока от токов записаны во время напряжения рампы в 20 мМ Са 2 +-содержащих ванны Решение № 2 (20 Ca), и ванной решение № 3 (DVF) показано на графике (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Электрофизиологические исследования CRAC токи в состоянии покоя человека Т-клеток является сложной задачей, поскольку эндогенный CRAC амплитуды тока в этих клетках мало из-за небольшого размера ячейки (отдыха человека Т-клеток диаметром в диапазоне 5-8 мкм). Здесь мы представляем шаг за шагом процедуры надежно записи CRAC токи в состоянии покоя человека Т-лимфоциты изолированы от мононуклеарных клеток периферической крови. Эта технология позволяет исследовать физиологию и функциональные выражения CRAC каналов в состоянии покоя Т-клетки, чтобы лучше понять природу нормальных и патологических иммунных реакций клеток. Используя этот протокол, можно измерить CRAC токи в состоянии покоя человека Т-клеток, а также в другие клетки иммунной системы, таких как активированный человеческий Т-клеток, моноцитов и макрофагов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарны кафедры физиологии и мембранной биологии Калифорнийского университета Дэвиса за предоставление нам помещения и отличные условия для исследования ионных каналов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
