Summary
ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لخلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك من الكالسيوم النسخة المنشط الكالسيوم (CRAC) التيارات المحيطية في الدم وحيدات النوى الخلية المستمدة اللمفاويات التائية البشرية.
Abstract
في الخلايا اللمفية تي ، واستنزاف الكالسيوم من 2 + 2 + الكالسيوم داخل الخلايا يؤدي إلى تخزين تفعيل البلازمي كا 2 + القنوات ، ودعا الكالسيوم النسخة المنشط الكالسيوم (CRAC) القنوات. قنوات CRAC تلعب دورا هاما في تنظيم تكاثر الخلايا T والتعبير الجيني. وقد تم ربط وظيفة غير طبيعي في خلايا CRAC قناة تي الشديدة للأمراض نقص المناعة والجمع بين الذاتية 1 و 2. قد تدرس CRAC ظيفة القناة في الخلايا التائية البشرية كشف الآليات الجزيئية الجديدة التي تنظم الاستجابات المناعية الطبيعية وكشف عن أسباب الأمراض التي تصيب الإنسان ذات الصلة. تسجيلات للتيارات الكهربية غشاء تقديم تقييم أكثر دقة لخصائص قناة الفنية وتنظيمها. أجري أول تقييم للتيارات الكهربية قناة CRAC في الخلايا التائية Jurkat ، تي سرطان الدم البشري خط خلية ، وأكثر من 20 عاما منذ 3 ، ومع ذلك ، والقياسات الحالية في CRAC العادي الخلايا التائية البشرية يظل مهمة صعبة. ومما يزيد من الصعوبات في تسجيل التيارات قناة CRAC في خلايا T العادية من خلال حقيقة أن الدم المستمدة من الخلايا اللمفية تي هي أصغر بكثير في الحجم من الخلايا التائية Jurkat ، وبالتالي ، فإن التيارات الذاتية CRAC كامل الخلية منخفضة للغاية في السعة. هنا ، فإننا نقدم إجراء خطوة بخطوة التي نستخدمها عادة لتسجيل كا 2 + او + نا التيارات عبر قنوات CRAC يستريح الإنسان في الخلايا التائية المعزولة من الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء. وصف الأسلوب هنا اعتمد من الإجراءات المستخدمة لتسجيل والتيارات CRAC في الخلايا التائية Jurkat وتنشيط خلايا T 4-8.
Protocol
1. إعداد الخلايا اللمفية تي يستريح الإنسان
- كوكتيل باستخدام RosetteSep T الإنسان إثراء الخلية وRosetteSep متوسطة الكثافة ، وتنقية خلايا تي من عينات دم الإنسان وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وينبغي للسكان الخلية تحتوي على 95 ٪ من الناتج CD3 + الخلايا التائية يستريح. نحن تنقية الخلايا اللمفية تي الإنسان من عينات الدم التي تم جمعها من طرفي متطوعين أصحاء ، وفقا للبروتوكول التي وافق عليها مجلس جامعة كاليفورنيا في ديفيس مراجعة الداخلية.
- بعد العزلة ، resuspend الخلايا التائية يستريح في مناطق ذات كثافة تبلغ 0.5 X 6 10 خلايا / مل في مستنبت الخلايا التي تحتوي على RPMI - 1640 والمتوسطة مع الجلوتامين HEPES ، على أن تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين ، 2 ٪ GlutaMAX - I ، 1 ٪ RPMI 1640 فيتامين الحل ، 1 ٪ RPMI 1640 حل الأحماض الأمينية ، 1 ٪ البيروفات الصوديوم ، و 0.03 ٪ β - المركابتويثانول.
- مكان تعليق الخلية إلى خلية قوارير الثقافة والمحافظة على 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2 لتصل إلى 24 ساعة قبل التجربة.
2. إعداد غرفة تسجيل
- وهناك حاجة إلى ما يلي لإعداد غرف التسجيل : أ) السيليكون O - الخواتم وب) جولة ، 25 ملم coverslips تنظيفها مع الايثانول 70 ٪ والمقطر H 2 O ، ج) مختلطة Sylgard184 ، الذي أعد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، و) د two 60 × 15 مم أطباق بتري.
- المكان ~ 0.5 مل من Sylgard184 مختلطة في طبق بتري 60x15 ملم.
- تراجع الجزء السفلي من يا الدائري في ملقط Sylgard184 به.
- Sylgard184 إزالة الزائدة من حافة يا الدائري من خلال وضع خاتم O - على سطح نظيف ، مثل طبق بيتري أخرى.
- وضع عصابة على وساترة واضغط عليه باستمرار.
- علاج Sylgard184 عن طريق تسخين الغرف في 85 درجة مئوية لمدة غير بلمرة 40-60 دقيقة أو حتى Sylgard184.
- غرف تخزين تسجيل في حاوية خالية من الغبار.
3. إعداد تصحيح الماصات
- في يوم من التجربة ، وسحب ماصات بقطر غيض ~ 2 ميكرون باستخدام الزجاج الشعيرات الدموية ومجتذب ماصة. نستخدم أنابيب البورسليكات مع خيوط (OD : 1.5 مم ومعرف : 1.10 ملم). ماصات تخزينها في مكان خال من الغبار.
- معطف ماصة نصائح مع Sylgard184 HIPEC أو طلاء واقية R6101 أشباه الموصلات ، وفقا لإجراءات موحدة 9.
- بلطف النار تلميع ماصات قبل التجربة.
4. إعداد التصحيح الإعداد المشبك
- تكوين وحفظ وحدات الماكرو لتشكيل gigaseal في برنامج التحكم الخاص التصحيح ، المشبك مكبر للصوت. علينا استخدام مكبر للصوت EPC - 10 التي يدعمها نظام التشغيل Windows XP ونبض البرامج للحصول على البيانات. وضعنا "انشاء" ، و "الخلية" ، و "خلية كاملة" وحدات الماكرو وفقا لدليل EPC - 10 واستخدامها لجميع التجارب.
- إعداد الحلول والحلول حمام ماصة المدرجة في الجدول رقم 1 قبل التجربة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
| المواد الكيميائية | حلول حمام (ملم) | ماصة حلول (ملم) | ||
| # 1 | # 2 | # 3 | ||
| CH 3 SO 3 نا | 130 | 110 | 125 | -- |
| كلوريد الصوديوم | 2 | 4 | 5 | -- |
| CA (OH) 2 | -- | 20 | -- | -- |
| MgCl 2 | 3 | 1 | -- | 5 |
| MgSO 4 | -- | -- | -- | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | -- | 10 | -- | |
| EDTA | -- | -- | 1 | -- |
| CS - Aspartate | -- | -- | -- | 125 |
| BAPTA | -- | -- | -- | 12 |
| جلوكوز | 10 | 10 | 10 | -- |
الجدول 1. حلول للتسجيلات كامل الخلية الحالية CARC.
وقد تم شراء جميع المواد الكيميائية من سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO.
- تحديد امكانات تقاطع السائلة (LJ) بين التصحيح وماصة حل كل حل حمام 10. حفظ القيمة LJ في المكان المناسب باستخدام برنامجك الاستحواذ. على سبيل المثال ، في برنامج نبض إدراج القيمة LJ في السيطرة "LJ" في إطار "مكبر للصوت".
- تكوين وحفظ بروتوكولات التحفيز ، كما هو مبين في الشكل رقم 1 ، في المكان المناسب لشراء البرمجيات الخاصة بك قبل التجارب. في برنامج نبض ، وضعنا بروتوكول الاستحواذ في إطار "نبض الجيل".
الشكل 1. يتم تطبيق بروتوكول التحفيز منحدر الجهد من -120 إلى +100 بالسيارات من 50 مللي ثانية في كل مدة 0.2 -- 2 ثانية (5-0،5 هرتز). يتم الاحتفاظ المحتملة عقد (V ح) بين المنحدرات في +30 بالسيارات.
5. تركيب خلايا في مرحلة مجهر
- معطف غرف تسجيل مع بولي - L - يسين عن 20 دقيقة ويغسل ~ مع H 2 O ثم بمحلول ملح متوازن هانك (HBSS) قبل طلاء الخلايا.
- لوحة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تحتوي على 6 خلايا X10 0،2-0،5 في الغرفة واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تأمين غرفة تسجيل مع خلايا يعلق في حامل الغرفة. نستخدم حامل غرفة مخصصة الصنع ، حيث يدعم قاعدة أسفل ساترة ، في حين أن الجزء العلوي يضغط برفق على الجزء العلوي من ساترة.
- مكان صاحب الغرفة على مرحلة من مراحل المجهر المقلوب.
- التركيز على الخلايا في ضوء المنقولة. نستخدم الغمر النفط 40X الهدف.
- مكان القطب المرجعية حج / AgCl في الحمام.
- محاذاة multibarrel ، ونظام الجاذبية نضح يحركها. ينبغي أن توضع غيض من أنبوب تدفق بزاوية 45 درجة إلى إغلاق ساترة لمجال الرؤية.
- موقف معاكس لأنبوب الشفط غيض من أنبوب تدفق.
- يروي الغرفة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو HBSS ليغسل وسائل الإعلام والثقافة الخلية خلايا فضفاضة يعلق.
6. CRAC تسجيل قناة التيارات
- العثور على الخلية التي ترتبط بقوة مع ساترة. نختار عادة متوسط الحجم ، مستديرة مع خلية السطح الخارجي على نحو سلس.
- يروي غرفة تسجيل مع كا 2 + خالية ، 3 مم 2 ملغ حل حمام + التي تحتوي على رقم 1 (الجدول 1) التي تحتوي على 0،5-1 thapsigargin ميكرومتر لمدة 8-10 دقيقة لمنع ضخ SERCA. نقوم بهذه الخطوة لتخزين تستنفد قبل تشكيل gigaseal.
- باستخدام microloader إيبندورف وماصة P - 20 التشريد ، وملء ماصة التصحيح مع الحل ماصة (الجدول 1) وإدراج ماصة التصحيح في حامل ماصة على headstage مكبر للصوت. كا 2 + خالب يتم تضمينها في حل BAPTA ماصة لتستنزف بشكل سلبي على تخزين والحد من الكالسيوم 2 + التي تعتمد على تعطيل قناة CRAC.
- تنطبق على كمية صغيرة من الضغط الايجابي (~ 3 بوصات من H 2 O) داخل ماصة التصحيح قبل دخول الحمام. نستخدم مصنوعة خصيصا للضغط الشفط الجهاز متصلا وخطوط الهواء المضغوط لخلق فراغ ضغط إيجابية أو سلبية داخل ماصة التصحيح.
- انخفاض ماصة التصحيح في الحمام تحت المراقبة البصرية من خلال المجهر. في إطار "راسمة الذبذبات" ، سترى الحالية التي تتدفق من خلال ماصة. يجب أن تحاسب أي تغيير مثل الخطوة في السعة الحالية نبضة صغيرة السعة الجهد (اختبار النبض) التي تطبقها الماكرو مسبقا. في هذا الوقت ، يجب أن تكون قادرة على تحديد قيمة المقاومة ماصة. مقاومة ماصات لدينا عادة MΩ 5-6.
- الصحيح "الأوفست" ولدت المحتملة بين ماصة والإلكترود المرجعي.
- تحت المراقبة البصرية من خلال المجهر ، وجلب رأس ماصة أقرب إلى الخلية حتى يلمس غشاء الخلية.
- الضغط السلبي (20-40 بوصة من H 2 O) داخل ماصة التصحيح.
- رصد تشكيل gigaseal في إطار "الذبذبات". سوف تشاهد السعة للتيار ، الناجمة عن نبض الاختبار ، ويقلل من قيمة الزيادات المقاومة ماصة ل> 5 GΩ. gigaseal عادة ضمن أشكال الحديدث ثانية ، ولكن قد يستغرق 1-2 دقيقة لتحقيق gigaseal مستقرة.
- تعويض عن السعة ماصة ("C - السريع").
- كسر الغشاء التصحيح عن طريق تطبيق الضغط السلبي إضافية باستخدام حقنة سم 20.
- تعيين محتمل لعقد +30 بالسيارات. وتوجد إمكانية عقد إيجابي يساعد على منع الكالسيوم التي تعتمد على قناة CRAC التعطيل.
- تعويض عن السعة غشاء الخلية ("C - بطيء") ؛ حفظ أو تسجيل قيمة C - بطيئة.
- تحقق من قيمة المقاومة وصول "آر اس". في تجاربنا ، ق R هو عادة 70-20 MΩ.
- البدء في تطبيق سلسلة من سلالم الجهد مع التردد من 0.5 هرتز (الشكل 1) في كاليفورنيا 2 + خالية من 3 مم 2 ملغ حل حمام + التي تحتوي على رقم 1. في هذا الحل ، CRAC الحالية هي صغيرة لا تذكر بالمقارنة مع تيار "تسرب" بسبب ضعف النفاذية للقنوات CRAC MG 2 +. حفظ واستخدام آثار الحالية المسجلة في حل حمام # 1 في التحليلات المستقبلية والتيارات "تسرب". ينبغي أن السعة الحالية المطلقة من "تسرب" في بالسيارات -100 تكون أقل من أو تساوي 5 السلطة الفلسطينية. إذا كانت الخلية "تسرب" ، إيقاف التجربة والبدء من جديد باستخدام ماصة التصحيح الجديدة وخلية جديدة.
- لتسجيل كا 2 + الحالية عبر قنوات CRAC (I - CRAC كاليفورنيا) ، استبدال كا 2 + خالية من 3 مم 2 ملغ حل حمام + التي تحتوي على الكالسيوم مع # 1 20 2 + ملي المحتوية على حل حمام # 2 (الجدول 1) بواسطة تبديل صمامات الارواء. وهذا يسمح للكا 2 + لتدفق عبر قنوات CRAC وإنتاج تيار الداخل. في إطار "راسمة الذبذبات" ، سترى تطوير تصحيح داخليا أنا الكالسيوم وCRAC (الشكل 2). فإن السعة الحالية في الفولتية السلبية تستمر في الزيادة لحوالي 1 دقيقة بسبب كا 2 + التي تعتمد على التقوية للتيار CRAC.
- زيادة وتيرة التحفيز مع سلالم الجهد إلى 5 هرتز ، وهو أمر ضروري لتسجيل نا + الحالية عابرة عبر قنوات CRAC.
- استبدال 20 ملي كا 2 + المحتوية على حل حمام + # 2 مع المحتوية على الصوديوم الموجبة خالية حل ثنائي التكافؤ # 3 (الجدول 1) بواسطة تبديل صمامات الارواء. في إطار "راسمة الذبذبات" ، سترى التنمية عابرة الكبيرة السعة تصحيح باطنه نا عبر قنوات CRAC (I - نا CRAC ؛ الشكل 2) + الحالي.
- يمكن للمرء أن تطبق كا 20 مم 2 + المحتوية على حل حمام # 2 1-5 ميكرومتر لا تحتوي على 3 + في نهاية التجربة إلى تسجيل "تسرب" الحالية. ومع ذلك ، لم نجد هذا النهج مفيدا لأن "تسرب" التغييرات الراهنة على مر الزمن وأنها قد تصبح أكبر أو أصغر في نهاية التجربة. نحن نفضل أن يتخذ الحالية المسجلة في كا 2 + خالية من 3 مم MG 2 + حمام المحتوية على حل # 1 في بداية التجربة بوصفها الحالي "تسرب".
- إنقاذ آثار سجلت الحالي لمزيد من التحليل.
7. تحليل البيانات
- استرداد السجلات المحفوظة الحالية في صناعة البرمجيات التحليل. نستخدم برنامج نبض للتحليل.
- قياس سعة الحالية في بداية ونهاية سلالم الجهد. نحن عادة قياس سعة الحالية في بالسيارات -100 و +100 في بالسيارات به زوجا من المؤشرات في إطار "راسمة الذبذبات" برنامج النبض.
- تصدير قيم سعة الحالية في برنامج الرسم لمزيد من التحليل والعرض الرسومية. نستخدم البيانية المنشأ والعلم وبرامج التحليل ، الإصدار 7.
8. ممثل النتائج
الشكل 2. التيارات CRAC في خلية الإنسان يستريح T (A) ، وبطبيعة الحال وقت التيارات CRAC سجلت في التكوين الجهد المشبك كامل الخلية في بالسيارات -100 (دوائر مليئة) و+100 بالسيارات (الدوائر المغلقة). قبل تشكيل gigaseal ، كان preincubated الخلية عن 10 دقيقة في كاليفورنيا ~ 2 + خالية من 3 مم MG 2 + حمام المحتوية على حل # 1 تحتوي على 0.5 ميكرومتر thapsigargin. بعد كسر في طبقت حلول حمام بالتسلسل على النحو التالي : كا 2 + خالية من 3 مم MG 2 + حمام المحتوية على حل # 1 (0 كا + 3 ملغ) ، تليها بنسبة 20 ملي كا 2 حمام + حل المحتوية # 2 (20 كا) ، يليه حمام حل ثنائي التكافؤ الكاتيون خالية # 3 (DVF) ، يليه حل حمام # 2 (20 كا). وقد حفز الخلية بسلسلة من سلالم الجهد كما هو مبين في الشكل 1. وكان تردد سلالم 5 هرتز في حل حمام # 3 (DVF) و 0.5 هرتز في كل الحلول الأخرى. نلاحظ التطور البطيء للأنا ، كاليفورنيا CRAC بعد تطبيق كا 2 + 20 ملي المحتوية على حل # 2 حمام والتنمية السريعة العابرة الأول نا CRAC في حل حمام DVF # 3. (B) ، اثار الممثل الحالي سجلت خلال سلالم الجهد في كا 2 + خالية من 3 مم 2 ملغ حل حمام + التي تحتوي على رقم 1 ("تسرب") ، و 20 ملي كا 2 + المحتوية على حل حمام # 2 (20 كا) ، والحل حمام # 3 (DVF). (C ، D) ، العلاقات الحالية ذات الجهد من الكالسيوم وأنا CRAC (C) وأنا نا CRAC (D) التي تم الحصول عليها من خلال طرح "تسرب" تيار من التيارات التي سجلت خلال سلالم ذات الجهد في 20 ملي كا 2 + التي تحتوي على حمام الحل # 2 (20 كا) ، والحل حمام # 3 (DVF) يظهر في لوحة (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التحقيق التيارات الكهربية في CRAC يستريح الإنسان خلايا T هي مهمة صعبة لأن السعة الحالية CRAC الذاتية في هذه الخلايا غير الصغيرة نظرا لحجم خلية صغيرة (الخلايا التائية يستريح الإنسان القطر في حدود 5-8 ميكرومتر). هنا ، نقدم إجراء خطوة بخطوة لتسجيل موثوق بها التيارات CRAC في الخلايا اللمفية تي يستريح الإنسان معزولة عن الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى. هذه التكنولوجيا تتيح لنا تحقيق في علم وظائف الأعضاء والتعبير الفنية للقنوات CRAC في الخلايا التائية يستريح إلى فهم أفضل لطبيعة الاستجابات الطبيعية والمرضية الخلايا المناعية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن للمرء قياس التيارات CRAC يستريح في الخلايا التائية البشرية وكذلك في الخلايا المناعية الأخرى ، مثل تنشيط خلايا T البشرية ، وحيدات ، والضامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لوزارة فسيولوجيا والأغشية علم الأحياء في جامعة كاليفورنيا ديفيس لتزويدنا مرافق وبيئة ممتازة للدراسات القنوات الأيونية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
