Summary
Ofrecemos un protocolo de paso a paso para la grabación de células enteras patch clamp de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) las corrientes en mononucleares de sangre periférica de células derivadas de los linfocitos T humanos.
Protocol
1. Preparación de los linfocitos T en reposo Humanos
- Utilizando RosetteSep Humanos Cocktail de enriquecimiento de células T y de densidad media RosetteSep, purificar las células T de muestras de sangre humana de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La población de células resultante debe contener un 95% CD3 + células T en reposo. Purificamos linfocitos T humanos de sangre periférica recogida de voluntarios sanos, de acuerdo con el protocolo aprobado por el Consejo de la Universidad de California Davis Revisión Interna.
- Tras el aislamiento, volver a suspender las células T en reposo, con una densidad de 0,5 x 10 6 células / ml en medio de cultivo celular que contiene medio RPMI-1640 con glutamina y HEPES, complementado con un 10% de suero fetal bovino, 2% Glutamax-I, 1% de RPMI 1640 vitamina solución, una solución de RPMI 1640% aminoácidos, 1% de piruvato de sodio, y el 0,03% β-mercaptoetanol.
- Lugar la suspensión de células en frascos de cultivo celular y mantener a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO 2 durante un máximo de 24 horas antes del experimento.
2. Preparación de la Cámara de grabación
- Los siguientes son necesarios para preparar las cámaras de grabación: a) el silicio O-rings, b) redondo, 25 mm cubreobjetos limpian con 70% de etanol y H 2 O destilada, c) las mezclas Sylgard184, preparados de acuerdo con las instrucciones del fabricante, yd) dos de 60 x 15 mm Petri.
- Lugar ~ 0,5 ml de la mezcla en un plato Sylgard184 60x15 mm-Petri.
- Sumerja la parte inferior de la junta tórica en la pinza Sylgard184 utilizando.
- Eliminar el exceso de Sylgard184 desde el borde del anillo mediante la colocación de la junta tórica en una superficie limpia, como la otra placa de Petri.
- Coloque el anillo en el cubreobjetos y se presiona.
- Curar la Sylgard184 por las cámaras de calefacción a 85 ° C durante 40-60 minutos o hasta que el Sylgard184 se polimeriza.
- Tienda de las cámaras de grabación en un recipiente de polvo.
3. Preparación de pipetas de parches
- En el día del experimento, tire pipetas con un diámetro de la punta ~ 2 micras utilizando capilares de vidrio y un extractor de la pipeta. Usamos tubos de borosilicato con filamento (OD: 1.5 mm y ID: 1,10 mm). Pipetas guárdela en un lugar libre de polvo.
- Escudo puntas de pipeta con Sylgard184 o HIPEC revestimiento Semiconductor R6101 de protección, de acuerdo con un procedimiento estándar de 9.
- Suavemente el fuego pulido las pipetas antes del experimento.
4. Preparación de la instalación de patch clamp
- Configurar y guardar las macros para la formación de gigaseal en el software que controla el amplificador de patch-clamp. Utilizamos un amplificador EPC-10 compatible con Windows XP y el software de pulso para la adquisición de datos. Hemos creado el "set-up", "en las células", y "conjunto de células" macros de acuerdo con el manual de EPC-10 y los utilizan para todos los experimentos.
- Preparar soluciones para baños y soluciones de la pipeta en la Tabla 1 antes del experimento y almacenarlas a 4 º C durante un máximo de 1 semana.
| Productos químicos | Soluciones de Bath (mM) | Pipeta Solutions (mM) | ||
| # 1 | # 2 | # 3 | ||
| CH 3 SO 3 Na | 130 | 110 | 125 | - |
| NaCl | 2 | 4 | 5 | - |
| Ca (OH) 2 | - | 20 | - | - |
| MgCl2 | 3 | 1 | - | 5 |
| MgSO4 | - | - | - | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| EDTA | - | - | 1 | - |
| CS-Aspartate | - | - | - | 125 |
| BAPTA | - | - | - | 12 |
| Glucosa | 10 | 10 | 10 | - |
Tabla 1. Soluciones para el conjunto de células grabaciones actuales CARC.
Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
- Determinar los potenciales de unión líquida (LJ) entre la solución de parche pipeta y cada solución del baño 10. Guardar el valor LJ en el lugar adecuado con el software de adquisición. Por ejemplo, en el programa Pulso insertar el valor en LJ "LJ" control en el "amplificador" de la ventana.
- Configurar y guardar los protocolos de estimulación, como se muestra en la Figura 1, en el lugar apropiado de su software de adquisición antes de los experimentos. En el programa Pulso, se establece el protocolo de adquisición en la "Generación de pulso" de la ventana.
Figura 1. . Protocolo de estimulación Rampa de tensión -120 a 100 mV de 50 ms de duración se aplica cada 0,2 a 2 s (5 a 0,5 Hz). Potencial de mantenimiento (V h) entre las rampas se mantiene en 30 mV.
5. Las células de montaje de la platina del microscopio
- Abrigo de las cámaras de grabación con poli-L-lisina de aproximadamente 20 minutos y lavar con H 2 O y luego con solución salina balanceada de Hank (HBSS) de las placas, las células.
- Placa de 500 l de suspensión celular que contiene 0,2-0,5 x 10 6 células en la cámara y se incuba durante 20 min a 37 ° C.
- Asegure la cámara de registro con las células colocadas en un soporte de cámara. Utilizamos un soporte de cámara a medida, donde la base soporta la parte inferior del cubreobjetos, mientras que la parte superior presiona suavemente contra la parte superior del cubreobjetos.
- Coloque el soporte de la cámara en la platina del microscopio invertido.
- Centrarse en las células de la luz transmitida. Nosotros usamos un objetivo de inmersión 40X.
- Coloque el electrodo de referencia Ag / AgCl en el baño.
- Alinear la multibarrel, impulsado por la gravedad del sistema de perfusión. La punta del tubo de entrada debe ser colocado en un ángulo de 45 ° hasta el fin cubreobjetos para el campo de visión.
- Coloque el tubo de aspiración frente a la punta del tubo de entrada.
- Perfusión de la cámara con tampón fosfato salino (PBS) o HBSS para lavar los medios de cultivo celular y las células unen libremente.
6. CRAC Canal Corrientes grabación
- Encontrar una célula que se une firmemente a la cubreobjetos. Por lo general selecciona uno de tamaño medio, de células redondas, con una superficie exterior lisa.
- Perfusión de la cámara de grabación con Ca 2 + libre, 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 (Tabla 1) que contiene 0.5-1 thapsigargin M durante 8-10 minutos para bloquear la bomba SERCA. Llevamos a cabo este paso al agotamiento de la tienda antes de la formación gigaseal.
- El uso de un microloader Eppendorf y un P-20 pipeta de desplazamiento, llenar el parche pipeta con la solución de la pipeta (Tabla 1) e insertar el parche pipeta en el soporte de la pipeta en el headstage amplificador. El Ca 2 + quelante BAPTA está incluido en la solución de la pipeta a agotar pasivamente la tienda y para reducir el Ca 2 +-dependiente de inactivación del canal CRAC.
- Aplique una pequeña cantidad de presión positiva (~ 3 cm de H 2 O) en el interior de la pipeta parche antes de entrar en el baño. Usamos una medida de presión y absorber dispositivo conectado a las líneas de aire a presión y vacío para crear presión positiva o negativa dentro de un parche pipeta.
- Baje el parche pipeta en el baño bajo control visual a través del microscopio. En el "osciloscopio" de la ventana, debería ver una corriente que fluye a través de la pipeta. Un cambio de ritmo-como en la amplitud de la corriente debe ser inducida por un pulso de amplitud pequeña tensión (prueba de impulso) aplicado por el macro preestablecido. En este momento, usted debería ser capaz de determinar el valor de la resistencia a la pipeta. La resistencia de nuestras pipetas es típicamente 6.5 mW.
- Corregir el "offset" potencial generada entre la pipeta y el electrodo de referencia.
- Bajo control visual a través del microscopio, llevar la punta de la pipeta cerca de la celda hasta que toque la membrana celular.
- Aplique una presión negativa (20-40 pulgadas de H 2 O) en el interior del parche pipeta.
- Monitorear la formación gigaseal en el "osciloscopio" de la ventana. Usted verá la amplitud de la corriente inducida por el pulso de prueba, disminuye y aumenta el valor de la resistencia a la pipeta> 5 GΩ. Por lo general, las formas gigaseal dentro de una few segundos, pero se puede tomar 1-2 minutos para lograr una gigaseal estable.
- Compensar la capacitancia pipeta ("C-Fast").
- Ruptura de la membrana de parches mediante la aplicación de presión negativa adicional usando una jeringa de 20 cc.
- Establecer el potencial de retención de 30 mV. Un potencial de retención positiva ayuda a evitar que el calcio dependientes de inactivación del canal CRAC.
- Compensar la capacitancia de la membrana de la célula ("C-lento"), guardar o registrar el valor de C-lento.
- Comprobar el valor de la resistencia de acceso "I s". En nuestros experimentos, la s R es típicamente 7.20 mW.
- Empezar a aplicar una serie de rampas de tensión con una frecuencia de 0.5 Hz (Figura 1) en Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1. En esta solución, la corriente CRAC es insignificante en comparación con la "fuga" de corriente debido a la poca permeabilidad de los canales CRAC para Mg 2 +. Guardar y utilizar las huellas corriente registró en la solución de baño # 1 en los futuros análisis de "filtrar" las corrientes. La amplitud absoluta de la "fuga" de corriente a -100 mV debe ser menor o igual a 5 PA. Si la célula es "permeable", detener la prueba y comenzar de nuevo con una pipeta nueva revisión y una nueva célula.
- Para grabar Ca 2 + a través de los canales actuales CRAC (I Ca-CRAC), sustitución de Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 mM Ca con 20 + 2 que contienen solución del baño # 2 (Tabla 1) al cambiar las válvulas de la perfusión. Esto permite Ca 2 + a fluir a través de los canales CRAC y producir una corriente hacia el interior. En el "osciloscopio" de la ventana, podrás ver el desarrollo del interior rectificar I Ca-CRAC (Figura 2). La amplitud de la corriente con tensiones negativas seguirá aumentando durante 1 min, debido a la Ca 2 +-dependiente de la potenciación de la CRAC actual.
- Aumentar la frecuencia de la estimulación con rampas de tensión a 5 Hz, lo que es necesario registrar el transitorio corriente de Na + a través de los canales CRAC.
- Vuelva a colocar el 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 con Na + que contienen cationes divalentes sin solución n º 3 (Tabla 1) al cambiar las válvulas de la perfusión. En el "osciloscopio" de la ventana, verás un desarrollo transitorio de mayor amplitud interior rectificar corriente de Na + a través de los canales CRAC (I Na-CRAC, Figura 2).
- Se puede aplicar 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2, que contiene 5.1 M La 3 + en el final del experimento para registrar la "fuga" de corriente. Sin embargo, no encontramos este enfoque es útil porque la "fuga" los cambios actuales en el tiempo y puede llegar a ser más grande o más pequeña al final del experimento. Nosotros preferimos aprovechar la corriente registrado en el Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 en el inicio del experimento como una "fuga" de corriente.
- Guarde las huellas registradas en curso para su posterior análisis.
7. Análisis de Datos
- Recuperar los registros guardados en el actual software de análisis. Utilizamos el programa de impulso para el análisis.
- Medir las amplitudes de corriente al principio y al final de las rampas de tensión. Nos suelen medir las amplitudes de corriente a -100 mV y 100 mV en el uso de pares de cursores en el "osciloscopio" de la ventana del programa de impulso.
- Exportar los valores de las amplitudes de corriente en un programa gráfico para su posterior análisis y presentación gráfica. Usamos gráfica origen científico y software de análisis, la versión 7.
8. Resultados representante
Figura 2. CRAC corrientes en una de las células T humanas en reposo. (A), Evolución temporal de las corrientes CRAC registrado en células enteras voltaje-clamp configuración a -100 mV (círculos llenos) y 100 mV (círculos). Antes de la formación gigaseal, el celular se incuba durante unos 10 min en Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 que contiene 0,5 M thapsigargin. Después del rodaje, las soluciones de baño se aplican de forma secuencial de la siguiente manera: Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 (0 + 3 Ca Mg), seguido de 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 (20 Ca), seguido por la solución de baño de cationes divalentes-free # 3 (DVF), seguido de solución del baño # 2 (20 Ca). La célula fue estimulado con una serie de rampas de tensión como se muestra en la Figura 1. La frecuencia de las rampas de los 5 Hz en la solución del baño # 3 (DVF) y 0,5 Hz en todas las otras soluciones. Tenga en cuenta el lento desarrollo de la I Ca-CRAC después de la aplicación de 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 y el rápido desarrollo transitoria de I Na-CRAC en la solución de baño de DVF N º 3. (B), Representante de las huellas actuales registrados en las rampas de tensión en Ca 2 + libre de 3 mM Mg 2 + que contienen solución del baño # 1 ("Escape"), 20 mM Ca 2 + que contienen solución del baño # 2 (20 Ca), y la solución de baño # 3 (DVF). (C, D), relaciones corriente-voltaje de la I Ca-CRAC (C) y Na-CRAC (D) restando "fugas" en curso de las corrientes registradas durante las rampas de tensión en 20 mM Ca 2 + que contienen baño solución # 2 (20 Ca), y la solución de baño # 3 (DVF) que se muestran en el panel (B).
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Discussion
La investigación electrofisiológica de las corrientes de CRAC en reposo las células T humanas es una tarea difícil debido a la amplitud endógeno CRAC actual en estas células es pequeño debido al tamaño de células pequeñas (el diámetro de descanso de células T humanas está en el rango de 5.8 micras). Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para registrar de forma fiable las corrientes CRAC en el descanso los linfocitos T humanos aislados a partir de células mononucleares de sangre periférica. Esta tecnología nos permite investigar la fisiología y la expresión funcional de los canales CRAC en células T en reposo para comprender mejor la naturaleza de las respuestas de las células normales y patológicas inmunológico. El uso de este protocolo, se puede medir corrientes CRAC en reposo las células T humanas, así como en otras células del sistema inmune, tales como las células T activadas humanos, monocitos y macrófagos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Estamos agradecidos con el Departamento de Fisiología y Biología de Membrana de la Universidad de California Davis para que nos proporciona las instalaciones y un excelente ambiente para los estudios de los canales iónicos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
