Summary
Vi erbjuder en steg-för-steg-protokoll för hel-cell patch clamp inspelning av kalcium Release-Aktivt Kalcium (CRAC) strömmar i perifera mononukleära celler som härrör från mänskliga T-lymfocyter.
Abstract
I T-lymfocyter, utarmning av Ca 2 + från intracellulära Ca 2 + butiken leder till aktivering av plasmalemmal Ca 2 +-kanaler, som kallas Kalcium Release-Aktivt Kalcium (CRAC) kanaler. CRAC kanalerna spelar en viktig roll i regleringen av T celltillväxt och genuttryck. Onormal CRAC-kanalen fungerar i T-celler har kopplats till svår kombinerad immunbrist och autoimmuna sjukdomar 1, 2. Studera CRAC kanal funktion i mänskliga T-celler kan avslöja nya molekylära mekanismer som reglerar normala immunsvaret och reda ut orsaker relaterade mänskliga sjukdomar. Elektrofysiologiska inspelningar av membranet strömmar ge den mest exakta bedömningen av funktionella kanal egenskaper och deras reglering. Elektrofysiologiska bedömning av CRAC kanal strömmar i Jurkat T-celler, en människa leukemi T-cell linjen, uruppfördes mer än 20 år sedan 3 är dock fortfarande CRAC aktuella mätningar i normala mänskliga T-celler en utmanande uppgift. Svårigheterna att inspelningen CRAC kanal strömmar i normala T-celler förvärras av det faktum att blodbaserade T-lymfocyter är mycket mindre i storlek än Jurkat T-celler, och därmed den endogena helcells-CRAC strömmar är mycket låg i amplitud. Här ger vi en steg-för-steg förfarande som vi rutinmässigt använder för att spela in Ca 2 + eller Na + strömmar via CRAC kanaler i vilande mänskliga T-celler som isolerats från perifert blod hos friska frivilliga. Den metod som beskrivs här antogs av de förfaranden som används för att registrera CRAC strömmarna i Jurkat T-celler och aktiverade mänskliga T-celler 4-8.
Protocol
1. Beredning av vila Human T-lymfocyter
- Använda RosetteSep Human T-cell Anrikning Cocktail och RosetteSep Densitet Medium, rena T-celler från mänskligt blod prover enligt tillverkarens anvisningar. Den resulterande cellpopulation ska innehålla 95% CD3 + vilande T-celler. Vi renar humana T-lymfocyter från perifert blod prover som tagits från friska försökspersoner i enlighet med det protokoll som godkändes av UC Davis Internal Review Board.
- Efter isolering resuspendera vilande T-celler vid en densitet av 0,5 x 10 6 celler / ml i cellodling medium som innehåller RPMI-1640 medium med glutamin och HEPES, kompletterad med 10% fetalt kalvserum, 2% GlutaMAX-I, 1% RPMI 1640 vitamin lösning 1% RPMI 1640 aminosyror lösning 1% natrium pyruvat och 0,03% β-merkaptoetanol.
- Placera cellsuspension i kolvar cellodling och bibehålla vid 37 ° C i en fuktig kuvös med 5% CO 2 upp till 24 timmar före experimentet.
2. Beredning av inspelning avdelningen
- Följande behövs för att förbereda inspelning kammare: a) silikon O-ringar, b) runda, 25 mm täckglas rengörs med 70% etanol och destillerat H 2 O, c) blandningar Sylgard184, beredd enligt tillverkarens anvisningar, och d) två 60 x 15 mm petriskålar.
- Placera ~ 0,5 mL av blandad Sylgard184 i en 60x15 mm petriskål.
- Doppa den nedre delen av O-ringen i Sylgard184 med pincett.
- Ta bort överflödigt Sylgard184 från kanten på O-ringen genom att placera o-ringen på en ren yta, t.ex. en annan petriskål.
- Placera ringen på täckglaset och trycka ner det.
- Bota Sylgard184 genom uppvärmning kamrarna vid 85 ° C i 40-60 min eller tills Sylgard184 är polymeriserat.
- Förvara inspelningen kammare i en dammfri behållare.
3. Beredning av Patch Pipetter
- På dagen för experimentet, dra pipetter med en ~ 2-ìm tip diameter med glas kapillärer och en pipett avdragare. Vi använder borosilikat slang med glödlampa (OD: 1,5 mm och ID: 1,10 mm). Förvara pipetter i en dammfri plats.
- Coat pipettspetsar med Sylgard184 eller HIPEC R6101 Semiconductor Rostskyddsmålning, enligt ett standardförfarande 9.
- Försiktigt brand polera pipetterna före försöket.
4. Patch Clamp Setup Förberedelse
- Konfigurera och spara makron för gigaseal bildas i mjukvaran styr din patch-clamp förstärkare. Vi använder oss av ett EPC-10 förstärkare som stöds av Windows XP och Pulse programvara för datainsamling. Vi sätter på "set-up", "on-cell" och "hela-cell" makron enligt EPC-10 handbok och använda dem för alla experiment.
- Förbered bad lösningar och lösningar pipetten anges i tabell 1 före experimentet och förvara dem vid 4 ° C i upp till 1 vecka.
| Kemikalier | Bad Solutions (MM) | Pipettera Solutions (MM) | ||
| # 1 | # 2 | # 3 | ||
| CH 3 SO 3 Na | 130 | 110 | 125 | - |
| NaCl | 2 | 4 | 5 | - |
| Ca (OH) 2 | - | 20 | - | - |
| MgCl 2 | 3 | 1 | - | 5 |
| MgSO 4 | - | - | - | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| EDTA | - | - | 1 | - |
| Cs-ettspartate | - | - | - | 125 |
| BAPTA | - | - | - | 12 |
| Glukos | 10 | 10 | 10 | - |
Tabell 1. Lösningar för helcells-Carc aktuella inspelningar.
Alla kemikalier som köptes från Sigma-Aldrich, St Louis, MO.
- Bestäm flytande trafikplats potentialer (LJ) mellan plåstret pipetten lösning och varje bad lösning 10. Spara LJ värdet på lämplig plats med hjälp av förvärvet programvara. Till exempel, i Pulse programmet för in LJ värde i "LJ" kontroll i "Förstärkare"-fönstret.
- Konfigurera och spara stimuleringsprotokoll, som visas i figur 1, på lämplig plats på din förvärvet programvaran innan experimenten. I Puls programmet satte vi förvärvet protokollet i "Pulse Generation"-fönstret.
Figur 1. . Stimulering protokoll Spänning ramp från -120 till +100 mV på 50 ms varaktighet tillämpas varje 0,2 till 2 s (5 - 0,5 Hz). Holding potential (V h) mellan ramper bibehålls på 30 mV.
5. Montering på Celler på mikroskop scenen
- Coat inspelningen kammare med poly-L-lysin för ~ 20 minuter och tvätta med H 2 O och sedan med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) innan plätering cellerna.
- Plate 500 mikroliter cellsuspension innehåller 0,2-0,5 x10 6 celler in i kammaren och inkubera i 20 minuter vid 37 ° C.
- Säkra inspelningen kammaren med bifogade cellerna i en kammare hållare. Vi använder en skräddarsydd kammare företagare, med basen stöder undersidan av täckglaset, medan den övre delen försiktigt pressar mot toppen av täckglas.
- Placera kammare hållaren på scenen av den inverterade mikroskopet.
- Fokus på cellerna i ljus. Vi använder en 40X objektiv oljeimmersion.
- Placera Ag / AgCl-referenselektrod i badet.
- Rikta in multibarrel, allvar-driven perfusion systemet. Spetsen på inflödet röret ska placeras i 45 ° vinkel mot täckglas nära synfältet.
- Placera sugröret motsatsen till toppen av inflödet röret.
- BEGJUTA kammaren med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller HBSS att tvätta bort media cellodling och löst bifogade celler.
6. CRAC Kanal Strömmar inspelning
- Hitta en cell som är fast knuten till täckglas. Vi väljer ofta en medelstor, rund cell med en slät utsida.
- BEGJUTA inspelningen kammare med Ca 2 +-fria, 3 mm Mg 2 +-innehållande bad lösning # 1 (tabell 1) innehåller 0,5-1 mikroM thapsigargin i 8-10 minuter att blockera SERCA pumpen. Vi utför detta steg att tömma butiken innan gigaseal bildas.
- Använda ett Eppendorf microloader och ett P-20 deplacement pipett, fyll plåstret pipetten med pipett lösning (tabell 1) och sätt plåstret pipetten i pipetten hållaren på förstärkaren headstage. Ca 2 + kelator BAPTA ingår i pipetten lösningen att passivt bryter butiken och för att minska Ca2 +-beroende CRAC kanal inaktivering.
- Applicera en liten mängd övertryck (~ 3 inches av H 2 O) inuti plåstret pipetten innan badet. Vi använder en skräddarsydd tryck-sug enheten ansluten till tryckluft och linjer vakuum för att skapa positiva eller negativa trycket inuti en patch pipett.
- Sänk plåstret pipetten i badet i visuell kontroll via mikroskop. I "Oscilloskop"-fönstret bör du se en ström flyter genom pipetten. En steg-liknande förändring i strömamplituden bör sättas igång med en liten amplitud spänning puls (test puls) som tillämpas av det förinställda makrot. Vid denna tid bör du kunna avgöra värdet på pipetten motstånd. Motståndet i vår pipetter är normalt 5-6 Mohm.
- Korrigera "offset" potentiell genereras mellan pipetten och referenselektrod.
- Enligt visuell kontroll via mikroskop, föra pipettspetsen närmare cellen tills den vidrör cellmembranet.
- Applicera undertryck (20-40 inches av H 2 O) inuti plåstret pipetten.
- Övervaka gigaseal bildas i "oscilloskopet"-fönstret. Du kommer att se amplituden på strömmen som induceras av testet pulsen minskar och värdet av pipetten motståndet ökar till> 5 GΩ. Vanligtvis gigaseal former inom en few sekunder, men det kan ta 1-2 minuter för att uppnå en stabil gigaseal.
- Kompensera för pipetten kapacitans ("C-Fast").
- Bryt plåstret membranet genom att tillämpa ytterligare negativt tryck med hjälp av en 20 cc spruta.
- Ställ innehavet potential till +30 mV. En positiv hålla potentiella hjälper till att förhindra kalcium-beroende CRAC kanal inaktivering.
- Kompensera för membranet kapacitans i cellen ("C-långsam"), spara eller spela in värdet på C-långsamt.
- Kontrollera värdet på den tillgång motstånd "r s". I våra experiment, är R är vanligtvis 7-20 Mohm.
- Börja med att tillämpa en serie av spänning ramper med en frekvens av 0,5 Hz (Figur 1) i Ca 2 +-fri 3 mM Mg 2 +-innehållande bad lösning # 1. I denna lösning är CRAC nuvarande försumbart små i jämförelse med den "läcka" ström på grund av den dåliga permeabiliteten CRAC kanaler för Mg 2 +. Spara och använda den aktuella spår in i badet lösning # 1 i framtida analyser som "läcka" strömmar. Den absoluta amplitud "läcka" ström vid -100 mV bör vara mindre än eller lika med 5 PA. Om cellen är "läckande", avbryta experimentet och börja om med en ny patch pipett och en ny cell.
- För att spela in Ca 2 + ström via CRAC kanaler (I Ca-CRAC), byta ut Ca 2 +-fri 3 mM Mg 2 +-innehållande bad lösning # 1 med 20 mm Ca 2 +-innehållande bad lösning # 2 (tabell 1) genom att byta perfusion ventiler. Detta möjliggör för Ca 2 + flöda via CRAC kanaler och producera en inre ström. I "Oscilloskop"-fönstret kommer du att se utvecklingen av invärtes åtgärda I Ca-CRAC (figur 2). Den nuvarande amplituden vid negativa spänningar kommer att fortsätta öka i ungefär 1 minut på grund av Ca2 +-beroende potentiering av CRAC ström.
- Öka frekvensen av stimulering med spänning ramper till 5 Hz, vilket är nödvändigt att registrera transienta Na + ström via CRAC kanaler.
- Byt ut 20 mM Ca 2 +-innehållande bad lösning # 2 med Na +-innehållande divalent katjon-free-lösning # 3 (tabell 1) genom att byta perfusion ventiler. I "Oscilloskop"-fönstret ser du en övergående utveckling av större amplitud invärtes korrigera Na + ström via CRAC kanaler (I Na-CRAC, Figur 2).
- Man får tillämpa 20 mM Ca 2 +-innehållande bad lösning # 2 innehåller 1-5 mikroM La 3 + i slutet av försöket att spela in "läcka" ström. Däremot hittade vi inte denna metod användbar eftersom den "läcka" aktuella förändringar över tiden och det kan bli större eller mindre vid slutet av experimentet. Vi föredrar att ta ström som registreras i Ca 2 +-fri 3 mM Mg 2 +-innehållande bad lösning # 1 i början av experimentet som en "läcka" ström.
- Spara det inspelade nuvarande spår för vidare analys.
7. Data Analysis
- Hämta den sparade aktuella poster i analysprogram. Vi använder Puls-program för analys.
- Mät den aktuella amplituder i början och slutet av spänningen ramper. Vi mäter vanligtvis den aktuella amplituden på -100 mV och 100 mV med hjälp av par av markörer i "Oscilloskop" fönster Pulse programmet.
- Exportera värden av nuvarande amplituder i ett grafiskt program för vidare analys och grafisk presentation. Vi använder Ursprung och grafer Analysis Software, version 7.
8. Representativa resultat
Figur 2. CRAC strömmar i en vilande människa T-cell. (A), Tid under CRAC strömmar in i hel-cellspänning-clamp konfiguration på -100 mV (fyllda cirklar) och 100 mV (öppna cirklar). Före gigaseal bildning var cellen förinkuberad för ~ 10 min i Ca2 +-fri 3 mM Mg 2 +-innehållande bad lösning # 1 och som innehåller 0,5 mikroM thapsigargin. Efter inbrott, var bad lösningar sekventiellt tillämpas enligt följande: Ca 2 +-fri 3 mM Mg 2 +-innehållande bad lösning # 1 (0 Ca + 3 mg), följt av 20 mM Ca 2 +-innehållande bad lösning # 2 (20 Ca), följt av divalent katjon-fria bad lösning # 3 (DVF), följt av bad lösning # 2 (20 Ca). Cellen var stimuleras med en serie av spänning ramper som visas i figur 1. Frekvensen av ramperna var 5 Hz i badet lösning # 3 (DVF) och 0,5 Hz i alla andra lösningar. Notera den långsamma utvecklingen av I Ca-CRAC efter applicering av 20 mm Ca 2 +-innehållande bad lösning # 2 och den snabba övergående utvecklingen av I Na-CRAC i DVF bad lösning # 3. (B), representant för nuvarande spår inspelade under spänning ramper i Ca 2 +-fri 3 mM Mg 2 +-innehållande bad lösning # 1 ("Läcka"), 20 mm Ca 2 +-innehållande bad lösning # 2 (20 Ca), och bad lösning # 3 (DVF). (C, D), ström-spänning relationer I Ca-CRAC (C) och jag Na-CRAC (D) erhålls genom att subtrahera "läcka" ström från strömmar registrerats under spänning-ramper i 20 mM Ca 2 +-innehållande bad lösning # 2 (20 Ca), och bad lösning # 3 (DVF) som visas i panelen (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den elektrofysiologiska undersökning av CRAC strömningar i vilande mänskliga T-celler är en utmanande uppgift, eftersom den endogena CRAC strömamplituden i dessa celler är liten på grund av småcellig storlek (vilande mänskliga T-cell diameter är i storleksordningen 5-8 mikrometer). Här presenterar vi en steg-för-steg-förfarande för att tillförlitligt spela CRAC strömmar i vilande humana T-lymfocyter som isolerats från perifert blod mononukleära celler. Denna teknologi tillåter oss att undersöka fysiologi och funktionella uttryck för CRAC kanaler i vilande T-celler för att bättre förstå vilken typ av normal och patologisk immunceller svar. Med hjälp av detta protokoll, kan en åtgärd CRAC strömmar i vilande mänskliga T-celler liksom i andra immunceller, så som aktiverad mänskliga T-celler, monocyter och makrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Institutionen för fysiologi och Membrane Biology, University of California Davis för att förse oss med resurser och en utmärkt miljö för studier av jonkanaler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
