Summary
我々は、末梢血単核細胞由来のヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流の全細胞パッチクランプ記録のためのステップバイステップのプロトコルを提供しています。
Abstract
Tリンパ球で、細胞内Ca 2 +ストアからのCa 2 +枯渇は、カルシウムのリリース-活性化カルシウム（CRAC）チャネルと呼ばれる細胞膜のCa 2 +チャネルの活性化につながる。 CRACチャネルは、T細胞の増殖と遺伝子発現の調節において重要な役割を果たしている。 T細胞の異常なCRACチャネル機能は、重症複合免疫不全や自己免疫疾患1、2にリンクされています。ヒトT細胞のCRACチャネルの機能を研究することは正常な免疫反応を調節する新たな分子メカニズムを明らかにし、関連するヒト疾患の原因を解明することができる。膜電流の電気生理学的記録は、機能的なチャネルのプロパティとその規制の最も正確な評価を行うこと。 Jurkat T細胞、ヒト白血病T細胞株、のCRACチャネル電流の電気生理学的評価が最初に20年以上前に3を実行された、しかし、正常なヒトT細胞におけるCRAC電流測定は困難な課題である。正常T細胞でCRACチャネル電流を記録するの難しさは、血液由来のTリンパ球は、Jurkat T細胞よりもはるかに小さいサイズと、従って、内因性の細胞全体のCRAC電流は振幅が非常に低いものであるという事実によって悪化されています。ここで、我々は日常的に健康なボランティアの末梢血から単離されたヒトT細胞の休止のCRACチャネル経由でのCa 2 +又はNa +電流を記録するために使用するステップバイステップの手順を与える。ここで説明する方法は、Jurkat T細胞および活性化ヒトT細胞4-8にCRAC電流を記録するために使用される手続きから導入されました。
Protocol
1。一休みするヒトTリンパ球の調製
- RosetteSepヒトT細胞の濃縮カクテルとRosetteSep密度培地を用いて、製造元の指示に従って、人間の血液サンプルからT細胞を精製する。結果として得られる細胞集団は95％CD3 +安静時のT細胞が含まれている必要があります。私たちは、カリフォルニア大学デービス校の内部審査委員会によって承認されたプロトコールに従って健康なボランティアから採取した末梢血サンプルからのヒトTリンパ球を精製する。
- 単離後、10％ウシ胎児血清、2％グルタミン- I、1％RPMI 1640を添加した、グルタミンおよびHEPESを含むRPMI - 1640培地を含む細胞培養培地中で0.5 × 10 6細胞/ mLの密度で休んでT細胞を再懸濁ビタミンソリューション、1％RPMI 1640アミノ酸液、1％ピルビン酸ナトリウム、および0.03％β-メルカプトエタノール。
- 場所細胞の細胞培養フラスコにサスペンション、°加湿インキュベーター中、5％CO 2で、最大24時間の前に実験に、37で維持する。
2。記録チャンバーの準備
- 以下は、録音室を準備するために必要とされる。）シリコンO -リング、b）のラウンドは、25mmの製造元の指示に従って調製Sylgard184を混ぜ、70％エタノールおよび蒸留H 2 Oで洗浄カバーグラス、C）、、およびd） 2つの60 X 15ミリメートルのペトリ皿。
- 場所〜60x15 mmのシャーレに混合Sylgard184 0.5 mLの。
- Sylgard184使用して鉗子にO -リングの底部を浸します。
- このような別のペトリ皿のような清浄表面上にO -リングを配置することにより、O -リングの縁から過剰Sylgard184を削除します。
- カバースリップの上にリングを置き、それを押してください。
- 85℃40〜60分間、またはSylgard184まで、Cが重合されている時にチャンバーを加熱することによってSylgard184を治す。
- 無塵容器に録音室に保管してください。
3。パッチピペットの準備
- 実験日に、ガラスキャピラリーやピペットプラーを使用して〜2μmの先端径でピペットを引き出します。私たちは、フィラメント（：1.5 mmとID：1.10 mm外径）とホウケイ酸塩チューブを使用してください。ほこりのない場所で保管してピペット。
- 標準的な手順9に従ってSylgard184またはHIPEC R6101の半導体保護コーティング、とコートは、ピペットチップ。
- 静かに実験前にピペットを火 - ポーランド語。
4。パッチクランプのセットアップの準備
- あなたのパッチクランプアンプを制御するソフトウェアでgigaseal形成のためのマクロを設定し、保存します。我々は、Windows XPやデータ取得用のパルスソフトウェアでサポートされているEPC - 10アンプを使用してください。我々は、EPC - 10マニュアルによると、"オンセル"、および"細胞全体の"マクロ"をセットアップ"を設定し、すべての実験のためにそれらを使用してください。
- 前の実験にお風呂のソリューションと、表1に記載されているピペットのソリューションを用意し、最大1週間は4℃で保管します。
| 化学物質 | バスソリューション（MM） | ピペットソリューションズ（MM） | ||
| 第1位 | ＃2 | 第3位 | ||
| CH 3 SO 3のNa | 130 | 110 | 125 | - |
| NaClの | 2 | 4 | 5 | - |
| のCa（OH）2 | - | 20 | - | - |
| MgCl 2の | 3 | 1 | - | 5 |
| MgSO 4を | - | - | - | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| EDTA | - | - | 1 | - |
| CS -spartate | - | - | - | 125 |
| BAPTA | - | - | - | 12 |
| グルコース | 10 | 10 | 10 | - |
表1。全細胞CARC現在のレコーディングのためのソリューション。
すべての化学物質はSigma - Aldrich、セントルイス、MOから購入した。
- パッチピペット溶液及び各浴溶液10との間の液体接合のポテンシャル（LJ）を決定します。あなたの集録ソフトウェアを使用して適切な場所にLJの値を保存します。例えば、パルスのプログラムで"アンプ"ウィンドウで"LJ"の制御にLJの値を挿入します。
- 実験前に買収のソフトウェアの適切な場所で、図1に示すように、刺激プロトコルを、構成し、保存します。パルスのプログラムでは、我々は"パルス生成"ウィンドウで、買収のプロトコルを設定します。
図1。 2の（5 - - 0.5 Hz）の刺激のプロトコルは、-120から持続時間50ミリ秒の100 mVまでの電圧ランプはすべての0.2に適用されます。ランプの間に保持電位（V H）が 30 mVに保持されます。
5。顕微鏡ステージ上に取り付けセル
- 細胞を播種前にして〜20分と洗浄H 2 Oとし、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を持つためのポリ- L -リジンでコーティング録音室を。
- 37℃で20分間チャンバー内でインキュベート中に0.2〜0.5 × 10 6個の細胞を含む細胞懸濁液のプレート500μL℃に
- チャンバーのホルダーに付着した細胞と録音室を確保する。我々は、ベースはカバースリップの上に対して上部軽く押したまま、カバーの底部をサポートするカスタムメイドのチャンバーのホルダーを、使用してください。
- 倒立顕微鏡のステージ上のチャンバホルダーを置きます。
- 透過光で細胞に焦点を当てる。我々は、40X油浸対物レンズを使用。
- 浴中にAg / AgCl参照電極を置きます。
- multibarrel、重力駆動型の灌流システムを合わせます。流入管の先端が視野にカバースリップの近くに45 °の角度で配置する必要があります。
- 流入管の先端に吸引管の反対側に置きます。
- でチャンバーを灌流リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはHBSSは、細胞培養培地とゆるく付着した細胞を洗い流す。
6。 CRACチャネル電流の記録
- しっかりとカバースリップに接続されているセルを見つける。我々は一般的に滑らかな外表面を持つ平均的なサイズの、円形セルを選択します。
- 3mMのMg 2 +の含有浴溶液SERCAポンプをブロックするために8〜10分間0.5から1μMのタプシガルギンを含む第1位（表1）、+ -遊離Ca 2録音室を灌流。我々は、前のgigaseal形成へのストアを枯渇させるために、この手順を実行します。
- エッペンドルフmicroloaderとP - 20変位のピペットを使用して、ピペット溶液（表1）でパッチピペットを記入し、アンプのヘッドステージ上にピペットホルダーにパッチピペットを挿入する。 のCa 2 +キレート剤BAPTAは、受動的に店舗を破壊すると+ -依存性のCRACチャネルの不活性化のCa 2を減らすためにピペット溶液に含まれています。
- パッチピペット内の風呂に入る前に、正圧（H 2 Oの〜3インチ）の少量を適用します。我々は、パッチピペット内部に、正または負圧を作成するための圧縮空気と真空ラインに接続されたカスタムメイドの圧力吸引装置を使用してください。
- 顕微鏡を介して視覚的なコントロール下でバスにパッチピペットを下げます。 "オシロスコープ"ウィンドウでは、ピペットを流れる電流が表示されるはずです。電流振幅のステップ状の変化がプリセットマクロによって適用される小振幅の電圧パルス（試験パルス）によって誘発されるべきである。この時点では、ピペットの抵抗の値を決定することができるはずです。私たちのピペットの抵抗は、通常、MΩ5月6日です。
- ピペットと参照電極間に生成された"オフセット"の可能性を修正してください。
- それは細胞膜に触れるまで、顕微鏡を介して視覚的制御の下で、近い細胞にピペットの先端をもたらす。
- パッチピペット内部の負圧（H 2 Oの20〜40インチ）を適用します。
- "オシロスコープ"ウィンドウでgigaseal形成を監視します。あなたは、テストパルス、減少し、> 5GΩにピペット抵抗の値が増加することによって誘導される電流の振幅を、表示されます。 FE以内gigasealフォームwの数秒が、それは安定したgigasealを達成するために1〜2分かかる場合があります。
- ピペット容量（"C -ファースト"）を補償する。
- 20ccの注射器を使用して追加の負圧を適用してパッチ膜を破る。
- 30 mVに保持電位を設定します。正の保持電位は、カルシウム依存CRACチャネルの不活性化を防ぐことができます。
- 細胞の膜容量（"C -遅い"）を補償C -遅いの値を保存または記録する。
- アクセス抵抗"R s"の値を確認してください。我々の実験では、R sは 、通常、MΩ70から20までです。
- のCa 2 0.5 Hzの周波数（図1）+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1の電圧ランプのシリーズを適用し始める。 Mg 2 +のためのCRACチャネルの低透過性のために"リーク"現在と比較してこのソリューションでは、CRAC電流は無視できるほど小さいです。 "漏れ"電流のように将来の分析で浴溶液＃1に記録されている現在のトレースを保存して使用してください。 -100 mVで"リーク"電流の絶対振幅は、以下または5 pAのと同じである必要があります。セルが"漏れ"の場合は、新しいパッチピペットと新しいセルを使用する場合に比べて実験してスタートを停止する。
- CRACチャネル（I のCa - CRAC）経由でのCa 2 +電流を記録するには、 潅流バルブを切り替えることで20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2（表1）でのCa 2 + -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1を交換してください。これは、Ca 2 +のCRACチャネルを経由してフローすることを可能にし、内向き電流を生成する。 "オシロスコープ"ウィンドウでは、内側に私のCa - CRAC（図2）整流の開発が表示されます。負電圧での電流の振幅は、CRAC電流のCa 2 +依存性増強のために約1分間増加していきます。
- 一過性のNa + CRACチャネルを介して電流を記録するために必要な5 Hzの、の電圧ランプの刺激の頻度を増加させる。
- Na +の含有二価カチオンを含まない灌流バルブを切り替えることにより、ソリューション＃3（表1）と20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2を交換してください。 "オシロスコープ"ウィンドウでは、内向きのNa + CRACチャネル（;図2 I のNa - CRAC）を介して電流整流大きな振幅の過渡的な開発が表示されます。
- 一つは、現在の"リーク"を記録するために実験の終了時に1から5μMラ3 +を含む20mMのCa 2 +含有浴溶液＃2を適用される場合があります。しかし、我々は時間をかけて"リーク"電流が変化するため、このアプローチが有用見つけることができませんでしたし、それは実験の終了時に大きくまたは小さくなる場合があります。私たちは、"リ ーク"現在として実験の開始時に現在のCa 2で記録した+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1を取ることを好む。
- さらに分析するために記録された現在のトレースを保存します。
7。データ解析
- 解析ソフトウェアに保存されている現在のレコードを取得。我々は分析のためにパルスプログラムを使用してください。
- 初めに、電圧ランプの終わりに現在の振幅を測定します。我々は、通常、-100 mVで、パルスプログラムの"オシロスコープ"ウィンドウ内のカーソルのペアを使用して100 mVでの電流振幅を測定する。
- さらに分析およびグラフィカルなプレゼンテーションのためのグラフィックプログラムに現在の振幅の値をエクスポートします。我々は、Origin科学グラフと解析ソフトウェア、バージョン7を使用してください。
8。代表的な結果
図2。安静時のヒトT細胞におけるCRAC電流。（）、-100 mVの（黒丸）と+100 mVの（白丸）でのホールセル電圧クランプ構成で記録されたCRAC電流の時間経過。 gigaseal形成に先立って、細胞を、Ca 2年〜10分間プレインキュベーションした+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液、0.5μMのタプシガルギンを含む第1位。ブレークイン後、お風呂のソリューションは、順番に次のように適用されました：のCa 2 + -フリー3mMののMg 2のCa 2 +含有浴溶液＃2 20 mMのそれに続く+含有浴溶液＃1（0のCa + 3mg）を、 （20 Ca）の、浴溶液＃2（20 Ca）のに続いて二価カチオンを含まない浴溶液＃3（DVF）、続いて。セルは、図1に示すように電圧ランプのシリーズで刺激した。ランプの周波数は、浴溶液＃3（DVF）とすべての他のソリューションでは0.5 Hzで5Hzのだ。 20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2とDVFの浴溶液＃3の私のNa - CRACの高速過渡開発のアプリケーションの後に私のCa - CRACの遅い開発に注意してください。 （B）、代表、現在のトレースは、+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1（のCa 2に電圧ランプの間に記録さ"リーク"）、20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2（20 Ca）の、そして浴溶液＃3（DVF）。 （C、D）、私のCa - CRAC（C）と私のNa - CRAC（D）の電流-電圧の関係は、20mMの電圧ランプ中のCa 2 +含有お風呂に記録された電流から"リーク"電流を差し引いたパネル（B）に示すように解第2位（20 Ca）の、そして浴溶液＃3（DVF）。
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Discussion
これらの細胞中の内因性CRAC電流振幅が小さいセルサイズ（安静時のヒトT細胞の直径は5〜8μmの範囲にある）のために小さいため、ヒトT細胞の休止のCRAC電流の電気生理学的研究は困難な作業です。ここで、我々は確実に末梢血単核細胞から単離されたヒトTリンパ球を休んでCRAC電流を記録するためにステップバイステップの手順を示します。この技術は、私たちはより良い正常および病的な免疫細胞応答の性質を理解するために休止期T細胞のCRACチャネルの生理機能と機能発現を調べることができます。このプロトコルを使用して、一つはそのような活性化ヒトT細胞、単球、およびマクロファージのような他の免疫細胞にだけでなく、ヒトT細胞を休息にCRAC電流を測定することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、施設やイオンチャネルの研究のための優れた環境をご提供するための生理学と膜生物学、カリフォルニア大学デービス校の学科に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
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