Summary
Wir bieten Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für whole-cell Patch-Clamp-Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in peripheren mononukleären Zellen gewonnenen humanen T-Lymphozyten.
Abstract
In T-Lymphozyten, die Erschöpfung des Ca 2 + aus den intrazellulären Ca 2 + zu speichern führt zur Aktivierung von plasmalemmal Ca 2 +-Kanäle, genannt Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Kanäle. CRAC-Kanäle spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zell-Proliferation und Genexpression. Abnormal CRAC-Kanal-Funktion in T-Zellen hat schwere kombinierte Immundefizienz und Autoimmunerkrankungen 1, 2 in Verbindung gebracht worden. Studieren CRAC-Kanal-Funktion in menschlichen T-Zellen können gemeinsam neue molekulare Regulationsmechanismen normalen Immunantwort und lösen die Ursachen verwandter Krankheiten beim Menschen. Elektrophysiologischen Ableitungen von Membran-Ströme liefern die genaue Beurteilung der funktionellen Kanal Eigenschaften und ihre Regulation. Elektrophysiologische Beurteilung der CRAC Kanal Ströme in Jurkat T-Zellen, einer menschlichen Leukämie-T-Zell-Linie, zuerst durchgeführt wurde mehr als 20 Jahren 3, jedoch bleibt CRAC Strommessungen in normalen menschlichen T-Zellen eine anspruchsvolle Aufgabe. Die Schwierigkeiten bei der Aufnahme CRAC Kanal Ströme in normalen T-Zellen werden durch die Tatsache, dass Blut gewonnene T-Lymphozyten viel kleiner als Jurkat T-Zellen und sind daher die endogene whole-cell CRAC Ströme sehr gering in der Amplitude zusammengesetzt sind. Hier geben wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, das wir regelmäßig verwenden, um die Ca 2 + Rekord oder Na +-Ströme über CRAC Kanäle in Ruhe menschlichen T-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden isoliert. Die hier beschriebene Methode wurde von den Verfahren für die Aufnahme der CRAC Ströme in Jurkat T-Zellen und aktivierten humanen T-Zellen 4-8 verwendet hat.
Protocol
1. Vorbereitung der Ruhe menschlichen T-Lymphozyten
- Mit RosetteSep Menschliche T-Zell-Anreicherung Cocktail und RosetteSep Density Medium, reinigen T-Zellen aus menschlichen Blutproben nach den Anweisungen des Herstellers. Die daraus resultierende Zellpopulation sollte 95% CD3 + ruhende T-Zellen. Wir reinigen menschlichen T-Lymphozyten aus dem peripheren Blutproben von gesunden Freiwilligen in Übereinstimmung mit dem Protokoll von der UC Davis Internal Review Board genehmigt gesammelt.
- Nach der Isolierung resuspendieren ruhende T-Zellen bei einer Dichte von 0,5 x 10 6 Zellen / ml in Zellkulturmedium RPMI-1640 Medium mit Glutamin und HEPES, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 2% Glutamax-I, 1% RPMI 1640 Vitamin-Lösung, 1% RPMI 1640 Aminosäuren-Lösung, 1% Natrium-Pyruvat und 0,03% β-Mercaptoethanol.
- Legen Sie Zellsuspension in Zellkulturflaschen und pflegen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bis zu 24 h vor dem Experiment.
2. Vorbereitung der Aufnahme Kammer
- Die folgenden sind notwendig, um die Aufnahme Kammern vorzubereiten: a) Silizium-O-Ringe, b) um, 25-mm Deckgläser mit 70% Ethanol und destilliertem H 2 O, C gereinigt) gemischt Sylgard184, zubereitet nach den Anweisungen des Herstellers, und d) zwei 60 x 15 mm Petrischalen.
- Legen ~ 0,5 ml gemischt Sylgard184 in ein 60x15-mm-Petrischale.
- Tauchen Sie den unteren Teil der O-Ring in die Sylgard184 mit einer Pinzette.
- Entfernen Sie überschüssiges Sylgard184 vom Rand der O-Ring, indem Sie den O-Ring auf einer sauberen Fläche, wie eine weitere Petrischale.
- Platzieren Sie den Ring auf das Deckglas und drücken Sie ihn nach unten.
- Cure den Sylgard184 durch Erhitzen der Kammern bei 85 ° C für 40-60 min oder bis die Sylgard184 polymerisiert wird.
- Bewahren Sie die Aufnahme Kammern in einem staubfreien Behälter.
3. Erstellung von Patch-Pipetten
- Am Tag des Experiments, ziehen Pipetten mit a ~ 2-um Spitzendurchmesser mit Glaskapillaren und einer Pipette Abzieher. Wir verwenden Borosilikat Schlauch mit Filament (OD: 1,5 mm und ID: 1,10 mm). Shop-Pipetten in einem staubfreien Ort.
- Coat Pipettenspitzen mit Sylgard184 oder HIPEC R6101 Semiconductor Schutzschicht, nach einem Standard-Verfahren 9.
- Gently Feuer-polish die Pipetten vor dem Experiment.
4. Patch-Clamp-Setup Vorbereitung
- Konfigurieren und speichern Sie die Makros für Gigaseal Bildung in der Software-Steuerung Ihres Patch-Clamp-Verstärker. Wir verwenden ein EPC-10-Verstärker von Windows XP und Pulse-Software für die Datenerfassung unterstützt. Wir setzen die "set-up", "on-cell" und "whole-cell"-Makros nach dem EPC-10 Bedienungsanleitung und verwenden Sie sie für alle Experimente.
- Bereiten Bad-Lösungen und-Pipette Lösungen in Tabelle 1 aufgeführten vor dem Experiment und lagern Sie sie bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
| Chemicals | Bath Solutions (mM) | Pipette Solutions (mM) | ||
| # 1 | # 2 | # 3 | ||
| CH 3 SO 3 Na | 130 | 110 | 125 | - |
| NaCl | 2 | 4 | 5 | - |
| Ca (OH) 2 | - | 20 | - | - |
| MgCl 2 | 3 | 1 | - | 5 |
| MgSO 4 | - | - | - | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| EDTA | - | - | 1 | - |
| Cs-aspartate | - | - | - | 125 |
| BAPTA | - | - | - | 12 |
| Glucose | 10 | 10 | 10 | - |
Tabelle 1. Lösungen für whole-cell CARC aktuelle Aufnahmen.
Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich, St. Louis, MO gekauft.
- Bestimmen Sie Flüssigkeitsverbindung Potentiale (LJ) zwischen der Patch-Pipette Lösung und jede Badlösung 10. Speichern Sie die LJ-Wert an der entsprechenden Stelle mit Ihrem Erwerb Software. Zum Beispiel in der Pulse-Programm legen Sie die LJ-Wert in "LJ" Kontrolle im "Amplifier"-Fenster.
- Konfigurieren und speichern Sie die Stimulationsprotokolle, wie in Abbildung 1 gezeigt, an der entsprechenden Stelle Ihrer Software zur Erfassung, bevor die Experimente. In der Pulse-Programm setzen wir die Übernahme-Protokoll in der "Pulse Generation"-Fenster.
Abbildung 1. . Stimulationsprotokoll Spannungsrampe von -120 bis +100 mV von 50 ms Dauer wird alle 0,2 angewendet - 2 s (5 bis 0,5 Hz). Halten Potential (V h) zwischen Rampen ist bei +30 mV aufrechterhalten.
5. Montage Cells auf dem Mikroskoptisch
- Bestreichen Sie die Aufnahme Kammern mit Poly-L-Lysin für ~ 20 min und wäscht mit H 2 O und dann mit Hanks balanced salt solution (HBSS) vor dem Ausplattieren der Zellen.
- Platte 500 ul Zellsuspension mit 0,2-0,5 x10 6 Zellen in die Kammer und inkubieren für 20 min bei 37 ° C.
- Sichern Sie die Aufnahme Kammer mit der anhaftenden Zellen in eine Kammer Halter. Wir verwenden eine maßgeschneiderte Kammer Halter, wo die Basis unterstützt der Unterseite des Deckglases, während der obere Teil sanft drückt gegen die Oberseite des Deckglases.
- Setzen Sie die Kammer Halter auf der Bühne des inversen Mikroskop.
- Konzentrieren Sie sich auf die Zellen im Durchlicht. Wir verwenden ein 40X Ölimmersionsobjektiv.
- Legen Sie die Ag / AgCl-Referenzelektrode in die Wanne.
- Richten Sie die mehrgehäusigen, Schwerkraft-Perfusion System. Die Spitze des Zulaufrohr sollte in einem 45 ° Winkel zur Deckglas in der Nähe des Sichtfeldes platziert werden.
- Positionieren Sie den Saugschlauch gegenüber der Spitze des Zulaufrohr.
- Versorgen die Kammer mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) oder HBSS abzuwaschen den Zellkulturmedien und lose anhaftenden Zellen.
6. CRAC-Channel Currents Recording
- Finden Sie eine Zelle, die fest mit dem Deckglas befestigt ist. Wir in der Regel wählen Sie einen durchschnittlich großen, runden Zellen mit einer glatten Außenfläche.
- Versorgen die Aufnahme Kammer mit Ca 2 +-frei, 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung # 1 (Tabelle 1) mit 0,5-1 pM Thapsigargin für 8-10 min auf die SERCA-Pumpe blockieren. Wir führen diesen Schritt, um das Geschäft vor Gigaseal Bildung führen.
- Mit einer Eppendorf Microloader und eine P-20 Pipette, füllen Sie die Patch-Pipette mit der Pipette Lösung (Tabelle 1) und legen Sie die Patch-Pipette in die Pipettenhalter am Verstärker headstage. Die Ca 2 +-Chelator BAPTA ist in der Pipette Lösung enthalten, passiv zum Abbau der zu speichern und Ca 2 +-abhängigen Inaktivierung CRAC Kanal zu reduzieren.
- Eine kleine Menge von positivem Druck (~ 3 Zoll H 2 O) in der Patch-Pipette vor dem Betreten des Bades. Wir verwenden eine maßgeschneiderte Druck-Saug-Gerät, das an Druckluft-und Vakuum-Leitungen zu positiven oder negativen Druck innerhalb einer Patch-Pipette zu schaffen.
- Senken Sie die Patch-Pipette in das Bad unter visueller Kontrolle über das Mikroskop. In der "Oszilloskop"-Fenster, sollten Sie einen Strom durch die Pipette. Eine Schritt-für, wie Änderung der Stromamplitude sollte durch eine kleine Amplitude Spannungsimpuls (Test-Impuls) durch die voreingestellten Makro angewendet induziert werden. Zu diesem Zeitpunkt sollte es möglich sein, den Wert der Pipette Widerstand zu bestimmen. Der Widerstand der Pipetten ist in der Regel 5-6 MOhm.
- Korrigieren Sie die "Offset" Potential zwischen der Pipette und der Referenz-Elektrode erzeugt.
- Unter visueller Kontrolle über das Mikroskop bringen die Pipettenspitze näher an die Zelle, bis sie die Zellmembran berührt.
- Bewerben Unterdruck (20-40 cm H 2 O) in der Patch-Pipette.
- Überwachen Sie die Gigaseal Bildung in der "Oszilloskop"-Fenster. Sie sehen die Amplitude des Stromes, durch den Test Puls sinkt und der Wert der Pipette Widerstand steigt auf> 5 GOhm induziert. Normalerweise Gigaseal Formen innerhalb einer few Sekunden, aber es kann 1-2 min, um eine stabile Gigaseal erreichen.
- Kompensieren Sie die Pipette Kapazität ("C-Fast").
- Break the patch Membran durch zusätzliche Unterdruck mittels einer 20 ml-Spritze.
- Stellen Sie die Haltepotential bis +30 mV. Eine positive Haltepotential hilft, Calcium-abhängigen Inaktivierung CRAC Kanal zu verhindern.
- Ausgleich für die Membran Kapazität der Zelle ("C-slow"); speichern oder notieren Sie den Wert von C-slow.
- Überprüfen Sie den Wert des Zugangs Widerstand "R s". In unseren Experimenten ist die R s in der Regel 7-20 MOhm.
- Starten Sie zu einer Reihe von Spannung Rampen mit einer Frequenz von 0,5 Hz (Abbildung 1) in Ca 2 +-freien 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung Nr. 1 gelten. In dieser Lösung ist CRAC aktuellen vernachlässigbar klein wie bei den "Leck" aktuellen aufgrund der schlechten Durchlässigkeit von CRAC Kanäle für Mg 2 + verglichen. Speichern und verwenden Sie die aktuelle Spuren in Badlösung Nr. 1 in zukünftigen Analysen aufgezeichnet als "Leck" Ströme. Die absolute Amplitude der "Leck" Strom bei -100 mV sollte weniger als oder gleich 5 pA. Wenn die Zelle "leaky", den Test beenden und neu zu beginnen mit einem neuen Patch-Pipette und eine neue Zelle.
- Zur Aufnahme Ca 2 + Strom über CRAC Kanäle (I Ca-CRAC), ersetzen Ca 2 +-freien 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung Nr. 1 mit 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung # 2 (Tabelle 1) durch Einschalten der Perfusion Ventile. Dies ermöglicht eine Ca 2 + zu fließen über CRAC Kanäle und erzeugen eine nach innen gerichteten Strom. In der "Oszilloskop" Fenster, sehen Sie die Entwicklung von nach innen Behebung I Ca-CRAC (Abbildung 2). Die Stromamplitude bei negativen Spannungen wird weiterhin für ca. 1 min durch die Ca 2 +-abhängige Potenzierung der CRAC aktuellen erhöhen.
- Erhöhen Sie die Frequenz der Stimulation mit Spannung Rampen bis 5 Hz, die notwendig sind, um die transiente Na + Strom über CRAC Kanäle aufnehmen wird.
- Ersetzen Sie die 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung # 2 mit Na +-haltigem zweiwertiges Kation-freie Lösung # 3 (Tabelle 1) durch Einschalten der Perfusion Ventile. In der "Oszilloskop" Fenster, sehen Sie eine vorübergehende Entwicklung größerer Amplitude innerlich Behebung Na + Strom über die CRAC-Kanäle (I Na-CRAC; Abbildung 2).
- Man kann gelten 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung Nr. 2 mit 1-5 uM La 3 + am Ende des Experiments, die "Leck" aktuellen Datensatz. Allerdings haben wir nicht finden, dieser Ansatz nützlich, da die "Leck" aktuelle Veränderungen im Laufe der Zeit und es kann größer oder kleiner werden am Ende des Experiments. Wir bevorzugen es, den Strom in der Ca 2 +-freien aufgezeichnet 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung # 1 am Anfang des Experiments als "Leck" Strom. Nehmen
- Speichern Sie die aufgezeichneten Strom Spuren für die weitere Analyse.
7. Data Analysis
- Abrufen der gespeicherten aktuellen Datensätze in die Analyse-Software. Wir nutzen die Pulse-Programm für die Analyse.
- Messen Sie den Strom Amplituden am Anfang und am Ende des Spannungsrampen. Wir messen typischerweise die Stromamplituden bei -100 mV und +100 mV unter Verwendung von Paaren von Cursor in die "Oszilloskop" Fenster der Pulse-Programm.
- Exportieren Sie die Werte der Stromamplituden in ein Grafikprogramm zur weiteren Analyse und grafische Darstellung. Wir verwenden Origin Wissenschaftliche Visualisierungs-und Analyse-Software, Version 7.
8. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 2. CRAC Ströme in einem ruhenden humanen T-Zell. (A), Zeitlicher Verlauf der CRAC Ströme in whole-cell Voltage-Clamp-Konfiguration bei -100 mV (gefüllte Kreise) und +100 mV (offene Kreise) aufgezeichnet. Vor Gigaseal Bildung, wurde die Zelle für ~ 10 min in Ca 2 +-freien vorinkubiert 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung Nr. 1 mit 0,5 uM Thapsigargin. Nach Einbruch, wurden Badlösungen nacheinander wie folgt angewandt: Ca 2 +-freien 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung # 1 (0 Ca + 3 Mg), gefolgt von 20 mM, gefolgt Ca 2 +-haltigen Badlösung # 2 (20 Ca), durch zweiwertige Kationen-freie Badlösung # 3 (DVF), gefolgt von Badlösung # 2 (20 Ca) gefolgt. Die Zelle wurde mit einer Reihe von Spannungsrampen wie in Abbildung 1 gezeigt, stimuliert. Die Häufigkeit der Rampen wurde 5 Hz in Badlösung # 3 (DVF) und 0,5 Hz in allen anderen Lösungen. Beachten Sie die langsame Entwicklung von I Ca-CRAC nach der Applikation von 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung Nr. 2 und die schnelle transiente Entwicklung von I Na-CRAC in DVF Badlösung Nr. 3. (B), Vertreter aktuellen Spuren während Spannungsrampen in Ca 2 +-freien aufgezeichnet 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung # 1 ("Leck"), 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung # 2 (20 Ca) und Badlösung # 3 (DVF). (C, D), Strom-Spannungs-Beziehungen von I Ca-CRAC (C) und ich Na-CRAC (D) durch Subtraktion "Leck" Strom aus der Strömung während des Spannungs-Rampen in 20 mM aufgezeichnet Ca 2 +-haltigen Bad erhalten Lösung # 2 (20 Ca) und Badlösung # 3 (DVF) in Panel dargestellt (B).
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Discussion
Die elektrophysiologische Untersuchung von CRAC Ströme in Ruhe menschlichen T-Zellen ist eine anspruchsvolle Aufgabe, da die endogene CRAC Stromamplitude in diesen Zellen ist wegen der geringen Größe der Zellen (die ruhende humane T-Zell-Durchmesser liegt im Bereich von 5-8 um). Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zuverlässig zu erfassen CRAC Ströme in Ruhe menschlichen T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen isoliert. Diese Technologie ermöglicht es uns, die Physiologie und funktionelle Expression von CRAC Kanäle in ruhenden T-Zellen zu untersuchen, um ein besseres Verständnis der Natur des normalen und pathologischen Immunsystem-Zell-Antworten. Mit diesem Protokoll kann man CRAC Ströme in Ruhe menschlichen T-Zellen als auch in anderen Immunzellen, wie beispielsweise die aktivierte humane T-Zellen, Monozyten und Makrophagen zu messen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass das Department of Physiology and Membrane Biology, University of California Davis, die uns mit Einrichtungen und ein ausgezeichnetes Umfeld für die Studien an Ionenkanälen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
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- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
