Summary
Wij bieden een stap-voor-stap protocol voor whole-cell patch clamp opname van calcium release-Activated Calcium (CRAC) stromingen in het perifere bloed mononucleaire cel afkomstige menselijke T-lymfocyten.
Abstract
In T-lymfocyten, uitputting van Ca 2 + van de intracellulaire Ca 2 + op te slaan leidt tot activatie van plasmalemmal Ca 2 +-kanalen, de zogenaamde Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) kanalen. CRAC kanalen spelen een belangrijke rol in de regulatie van de T-cel proliferatie en genexpressie. Abnormale CRAC kanaal functie in T-cellen is in verband gebracht met ernstige gecombineerde immunodeficiëntie en auto-immuunziekten 1, 2. Studeren CRAC kanaal functie in menselijke T-cellen kunnen ontdekken nieuwe moleculaire mechanismen tot regeling van een normale immuunrespons en ontrafelen van de oorzaken van verwante ziekten bij de mens. Elektrofysiologische registraties van membraan stromen de meest accurate beoordeling van de functionele kanaal eigenschappen en hun regelgeving. Elektrofysiologische beoordeling van de CRAC kanaal stromingen in Jurkat T-cellen, een menselijke leukemie T-cellijn, werd voor het eerst uitgevoerd meer dan 20 jaar geleden 3, echter, CRAC huidige metingen in normale menselijke T-cellen blijft een uitdagende taak. De moeilijkheden in de opname CRAC kanaal stromen in normale T-cellen worden nog verergerd door het feit dat op basis van bloed T-lymfocyten zijn veel kleiner in omvang dan Jurkat T-cellen en dus de endogene whole-cell CRAC stromingen zijn zeer laag in amplitude. Hier geven we een stap-voor-stap procedure die we regelmatig gebruiken om de Ca 2 + plaat of Na + stromen via CRAC kanalen in rustende humane T-cellen geïsoleerd uit het perifere bloed van gezonde vrijwilligers. De hier beschreven methode is overgenomen uit de procedures voor de registratie van de CRAC stromingen in Jurkat T-cellen en geactiveerde humane T-cellen 4-8.
Protocol
1. De voorbereiding van Resting Human T-lymfocyten
- Met behulp van RosetteSep humane T-cel Verrijking Cocktail en RosetteSep Density Medium, te zuiveren T-cellen uit menselijk bloed monsters volgens de instructies van de fabrikant. De resulterende celpopulatie moet bevatten 95% CD3 + rustende T-cellen. We zuiveren humane T-lymfocyten uit het perifere bloed monsters van gezonde vrijwilligers in overeenstemming met het protocol dat is goedgekeurd door de UC Davis interne Review Board.
- Na isolatie, resuspendeer rustende T-cellen bij een dichtheid van 0,5 x 10 6 cellen / ml in celkweek medium dat RPMI-1640 medium met glutamine en HEPES, aangevuld met 10% foetaal kalf serum, 2% Glutamax-I, 1% RPMI 1640 vitamine-oplossing, 1% RPMI 1640 aminozuren oplossing, 1% natrium pyruvaat, en 0,03% β-mercapto-ethanol.
- Plaats celsuspensie in celkweek kolven en te handhaven op 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 voor maximaal 24 uur voorafgaand aan het experiment.
2. De voorbereiding van de opname Kamer
- De volgende zijn nodig om de opname te vertrekken voor te bereiden: a) siliconen O-ringen, b) rond, 25-mm dekglaasjes schoongemaakt met 70% ethanol en gedestilleerd H 2 O, c) gemengde Sylgard184, bereid volgens de instructies van de fabrikant, en d) twee 60 x 15 mm petrischalen.
- Plaats ~ 0,5 ml van de gemengde Sylgard184 in een 60x15 mm petrischaal.
- Dompel het onderste deel van de O-ring in de Sylgard184 met behulp van pincet.
- Verwijder overtollig Sylgard184 van de rand van de O-ring door het plaatsen van de O-ring op een schoon oppervlak, zoals een andere petrischaal.
- Plaats de ring op het dekglaasje en druk het naar beneden.
- Cure de Sylgard184 door verhitting van de kamers bij 85 ° C gedurende 40-60 minuten of totdat de Sylgard184 wordt gepolymeriseerd.
- Bewaar de opname kamers in een stofvrije container.
3. Voorbereiding van de Patch Pipettes
- Op de dag van het experiment, trek pipetten met een ~ 2-um tip diameter met glas haarvaten en een pipet trekker. We maken gebruik van borosilicaat buis met gloeidraad (OD: 1,5 mm en ID: 1,10 mm). Bewaar pipetten in een stofvrije plaats.
- Coat pipetpunten met Sylgard184 of HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating, volgens een standaard procedure 9.
- Zacht vuur-polish de pipetten voor het experiment.
4. Patch Clamp Setup Voorbereiding
- Configureren en sla de macro's voor gigaseal vorming in de software de controle van uw patch-clamp versterker. We maken gebruik van een EPC-10 versterker ondersteund door Windows XP en Pulse-software voor de data-acquisitie. Zetten we de "set-up", "on-cel", en "whole-cell" macro's volgens de EPC-10 handleiding en gebruik ze voor alle experimenten.
- Bereid bad-oplossingen en oplossingen pipet in tabel 1 voorafgaand aan het experiment en bewaar ze bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
| Chemicaliën | Bath Solutions (mM) | Pipet Solutions (mM) | ||
| # 1 | # 2 | # 3 | ||
| CH 3 SO 3 Na | 130 | 110 | 125 | - |
| NaCl | 2 | 4 | 5 | - |
| Ca (OH) 2 | - | 20 | - | - |
| MgCl 2 | 3 | 1 | - | 5 |
| MgSO 4 | - | - | - | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| EDTA | - | - | 1 | - |
| Cs-eenspartate | - | - | - | 125 |
| BAPTA | - | - | - | 12 |
| Glucose | 10 | 10 | 10 | - |
Tabel 1. Oplossingen voor whole-cell CARC de huidige opnames.
Alle chemicaliën werden gekocht bij Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
- Bepaal vloeistof knooppunt potentials (LJ) tussen de patch pipet-oplossing en elk bad oplossing 10. Sla de LJ-waarde op de juiste plaats met behulp van uw acquisitie software. Bijvoorbeeld, insert in de Pulse-programma van de LJ waarde in "LJ" controle in de "versterker" venster.
- Configureren en sla de stimulatie protocollen, zoals weergegeven in figuur 1, op de juiste plaats van uw acquisitie software voor de experimenten. In het programma Pulse, zetten we de acquisitie protocol in de "Pulse Generation" venster.
Figuur 1. . Stimulatie protocol Voltage helling -120 tot 100 mV van 50 ms in lengte is toegepast elke 0,2 - 2 s (5 - 0,5 Hz). Holding potentiaal (V h) tussen de hellingen in stand wordt gehouden bij +30 mV.
5. Montage Cellen op de microscoop Stage
- De vacht van de opname kamers met poly-L-lysine voor ~ 20 min en was met H 2 O en dan met gebalanceerde zoutoplossing Hank's (HBSS) voor het uitplaten de cellen.
- Plaat 500 ul van de celsuspensie met 0,2-0,5 x10 6 cellen in de kamer en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
- Zet de opname kamer met de aangehechte cellen in een kamer houder. We maken gebruik van een op maat gemaakte kamer houder, waarbij de basis ondersteunt de onderkant van het dekglaasje, terwijl het bovenste deel zachtjes drukt tegen de bovenkant van het dekglaasje.
- Plaats de kamer houder op het podium van de omgekeerde microscoop.
- Focus op de cellen in doorvallend licht. We maken gebruik van een 40X olie-immersie objectief.
- Plaats de Ag / AgCl referentie-elektrode in het bad.
- Lijn de multibarrel, zwaartekracht-perfusie-systeem. De tip van de instroom buis moet worden geplaatst in een hoek van 45 ° naar de dekglaasje dicht bij het gezichtsveld.
- De positie van de zuigbuis tegenover de punt van de instroom buis.
- Perfuseren de kamer met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of HBSS weg te wassen de celcultuur media en losjes verbonden cellen.
6. CRAC Channel Stromingen opnemen
- Zoek een cel die stevig is aangesloten op het dekglaasje. We meestal kies een middelgrote, ronde cel met een gladde buitenkant.
- Perfuseren de opname kamer met Ca 2 +-vrij, 3 mM Mg 2 +-bevattende bad oplossing # 1 (tabel 1) met 0,5-1 uM thapsigargin voor 8-10 min om de SERCA pomp blokkeren. Wij voeren deze stap naar de winkel afbrekende voorafgaand aan de gigaseal formatie.
- Met behulp van een Eppendorf microloader en een P-20 verplaatsing pipet, vul de patch pipet met de pipet oplossing (tabel 1) en plaats de patch pipet in de pipet houder op de versterker headstage. De Ca 2 + chelator BAPTA is opgenomen in de pipet oplossing om passief afbrekende de winkel en Ca 2 +-afhankelijke CRAC kanaal inactivatie te verminderen.
- Breng een kleine hoeveelheid positieve druk (~ 3 centimeter van H 2 O) in de patch pipet voordat het bad. We maken gebruik van een op maat gemaakte druk-zuig apparaat dat is aangesloten op perslucht en vacuüm lijnen naar positieve of negatieve druk in een patch pipet te creëren.
- Laat de patch pipet in het bad onder visuele controle via de microscoop. In het "Oscilloscoop" venster, ziet u een stroom die door de pipet. Een stap-achtige verandering in de huidige amplitude moet worden opgewekt door een kleine amplitude spanningspuls (test puls) toegepast door de vooraf ingestelde macro. Op dit moment moet u in staat om de waarde van de pipet weerstand te bepalen. De weerstand van onze pipetten is typisch 5-6 MΩ.
- Corrigeer de "offset" potentieel gegenereerd tussen de pipet en de referentie-elektrode.
- Onder visuele controle via de microscoop, breng de pipetpunt dichter bij de cel totdat deze de celmembraan.
- Van toepassing zijn negatieve druk (20-40 centimeter van H 2 O) in de patch pipet.
- Monitor de gigaseal vorming in de "oscilloscoop" venster. U ziet de amplitude van de stroom, opgewekt door de test pols, afneemt en de waarde van de pipet weerstand toeneemt tot> 5 GΩ. Meestal gigaseal vormt binnen een few seconden, maar het kan 1-2 minuten om een stabiele gigaseal te bereiken.
- Compensatie van de pipet capaciteit ("C-Fast").
- Breek de patch membraan door het toepassen van extra negatieve druk met behulp van een 20 cc spuit.
- Stel de holding potentieel tot +30 mV. Een positief potentieel helpt om te voorkomen dat calcium-afhankelijke CRAC kanaal inactivatie.
- Compenseren voor het membraan capaciteit van de cel ("C-slow"), op te slaan of noteer de waarde van de C-traag.
- Controleer de waarde van de toegang weerstand "R s". In onze experimenten, de R s is meestal 7-20 MΩ.
- Begin van een reeks van hellingbanen spanning toe te passen met een frequentie van 0,5 Hz (figuur 1) in Ca 2 + vrij 3 mM Mg 2 +-bevattende bad oplossing # 1. In deze oplossing, CRAC stroom is verwaarloosbaar klein in vergelijking met het "lek" stroom te wijten aan de slechte doorlaatbaarheid van CRAC kanalen voor Mg 2 +. Opslaan en gebruiken van de huidige sporen die in bad oplossing # 1 in toekomstige analyses als "lekken" stromingen. De absolute amplitude van de 'lek' stroom bij -100 mV moet kleiner dan of gelijk aan 5 pA. Als de cel is "lek", stop het experiment en opnieuw beginnen met een nieuwe patch pipet en een nieuwe cel.
- Voor het opnemen van Ca 2 + stroom via CRAC kanalen (I Ca-CRAC), vervangen Ca 2 +-vrije 3 mM Mg 2 +-bevattende bad-oplossing # 1 met 20 mM Ca 2 +-bevattende bad oplossing # 2 (tabel 1) door over te schakelen van de perfusie kleppen. Dit zorgt voor Ca 2 + te laten stromen via CRAC kanalen en produceren een innerlijke stroom. In het "Oscilloscoop" venster ziet u de ontwikkeling van innerlijk rectificeren I Ca-CRAC (figuur 2). De huidige amplitude bij negatieve spanningen zullen blijven toenemen gedurende ongeveer 1 minuut als gevolg van de Ca 2 +-afhankelijke versterking van de CRAC stroom.
- De frequentie van de stimulatie met spanning hellingen tot 5 Hz, wat nodig is om de tijdelijke Na + huidige record via CRAC kanalen.
- Vervang de 20 mM Ca 2 +-bevattende bad oplossing # 2 met Na +-bevattende tweewaardige kation-vrije oplossing # 3 (tabel 1) door over te schakelen van de perfusie kleppen. In het "Oscilloscoop" venster ziet u een tijdelijke ontwikkeling van grotere amplitude innerlijk rectificeren Na + stroom via de CRAC kanalen (I Na-CRAC; Figuur 2).
- Men kan van toepassing zijn 20 mM Ca 2 +-bevattende bad oplossing # 2 met 1-5 uM La 3 + aan het eind van het experiment om de "lek" huidige record. Toch hebben we niet vinden deze aanpak nuttig omdat het "lek" de huidige veranderingen in de tijd en het kan groter of kleiner worden aan het eind van het experiment. Wij geven de voorkeur aan de huidige opgenomen in de Ca 2 + vrij 3 mM Mg 2 +-bevattende bad oplossing # 1 bij het begin van het experiment als een "lek" stroom. Te nemen
- Sla het op de lopende sporen voor verdere analyse.
7. Data Analysis
- Haal de opgeslagen huidige records in de analyse software. We maken gebruik van de Pulse-programma voor analyse.
- Meet de stroom amplitudes aan het begin en aan het eind van de spanning hellingen. We meten meestal de huidige amplitudes bij -100 mV en bij +100 mV met behulp van paren van cursors in het "Oscilloscoop" venster van het programma Pulse.
- Exporteer de waarden van de huidige amplitudes in een grafisch programma voor verdere analyse en grafische presentatie. We maken gebruik van Oorsprong Wetenschappelijk Graphing en analyse software, versie 7.
8. Representatieve resultaten
Figuur 2. CRAC stromen in een rustende humane T-cel. (A), Time loop van CRAC stromen opgenomen in whole-cell voltage-clamp configuratie bij -100 mV (gevulde cirkels) en +100 mV (open cirkels). Voorafgaand aan gigaseal vorming, werd de cel gepreïncubeerd voor ~ 10 min in Ca 2 + vrij 3 mM Mg 2 +-bevattende bad oplossing # 1 met 0,5 uM thapsigargin. Na de break-in, werden bad oplossingen sequentieel als volgt toegepast: Ca 2 + vrij 3 mM Mg 2 +-bevattende bad oplossing # 1 (0 + 3 Ca Mg), gevolgd door 20 mM Ca 2 +-bevattende bad oplossing # 2 (20 Ca), gevolgd door tweewaardige kation-vrije bad oplossing # 3 (DVF), gevolgd door bad-oplossing # 2 (20 Ca). De cel werd gestimuleerd met een reeks van spanning hellingen zoals weergegeven in figuur 1. De frequentie van opritten was 5 Hz in bad oplossing # 3 (DVF) en 0,5 Hz in alle andere oplossingen. Let op de trage ontwikkeling van I Ca-CRAC na het aanbrengen van 20 mM Ca 2 +-bevattende bad oplossing # 2 en de snelle ontwikkeling van voorbijgaande I Na-CRAC in DVF bad oplossing # 3. (B), vertegenwoordiger van de huidige sporen opgenomen tijdens spanning ramps in Ca 2 + vrij 3 mM Mg 2 +-bevattende bad oplossing # 1 ("Lek"), 20 mM Ca 2 +-bevattende bad oplossing # 2 (20 Ca), en bad oplossing # 3 (DVF). (C, D), Current-voltage relaties van I Ca-CRAC (C) en ik Na-CRAC (D) wordt verkregen door "lekken" stroom van de stromingen opgenomen tijdens voltage-ramps in 20 mM Ca 2 +-bevattende bad oplossing # 2 (20 Ca), en bad oplossing # 3 (DVF) weergegeven in panel (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De elektrofysiologische onderzoek van CRAC stromingen in rustende humane T-cellen is een uitdagende taak, omdat de endogene CRAC huidige amplitude in deze cellen is klein door de kleine celgrootte (de rustende humane T-cel met een diameter in het bereik van 5-8 um). Hier geven we een stap-voor-stap procedure om betrouwbaar te nemen CRAC stromingen in rustende humane T-lymfocyten geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen. Deze technologie stelt ons in staat om de fysiologie en de functionele expressie van CRAC kanalen in rustende T-cellen te onderzoeken om een beter inzicht in de aard van het normale en pathologische immuun cel responsen. Met behulp van dit protocol, kan men meten CRAC stromingen in rustende humane T-cellen evenals in andere immuuncellen, zoals geactiveerde humane T-cellen, monocyten en macrofagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We zijn dankbaar aan de afdeling Fysiologie en Membrane Biology, University of California Davis voor het aanbieden van ons met faciliteiten en een uitstekende omgeving voor de studie van ion-kanalen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
