Summary
Nous fournissons un protocole étape par étape pour la cellule entière d'enregistrement de patch-clamp de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) des courants dans les zones périphériques mononucléées du sang de cellules dérivées de lymphocytes T humains.
Abstract
Dans les lymphocytes T, l'épuisement de Ca 2 + de la intracellulaire de Ca2 + magasin conduit à l'activation des plasmalemmal Ca 2 + canaux, appelés calcium Release-Activated calcium (CRAC) des canaux. Canaux CRAC jouent un rôle important dans la régulation de la prolifération des cellules T et l'expression des gènes. Anomalie de la fonction de canal CRAC dans les cellules T a été liée à une immunodéficience sévère combinée et auto-immunes 1, 2. Etudier la fonction du canal CRAC dans les lymphocytes T humains peuvent découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires régulant les réponses immunitaires normales et de démêler les causes des maladies liées à l'humain. Enregistrements électrophysiologiques des courants membranaires fournissent l'évaluation la plus précise des propriétés fonctionnelles de canal et de leur régulation. L'évaluation électrophysiologique des courants des canaux CRAC dans les cellules T Jurkat, une ligne de la leucémie humaine des cellules T, a d'abord été effectué plus de 20 ans il ya trois, cependant, les mesures actuelles dans le CRAC lymphocytes T humains normaux reste une tâche difficile. Les difficultés dans l'enregistrement des courants de canal CRAC dans les cellules T normales sont aggravés par le fait que les dérivés du sang les lymphocytes T sont beaucoup plus petits en taille que les cellules T Jurkat et, par conséquent, les courants endogènes CRAC cellules entières sont très faibles en amplitude. Ici, nous donnons une procédure étape par étape que nous utilisent couramment pour enregistrer le Ca 2 + ou Na + courants via les canaux CRAC au repos des cellules T isolées du sang périphérique de volontaires sains. La méthode décrite ici a été adoptée par les procédures utilisées pour l'enregistrement des courants CRAC dans les cellules T Jurkat et activé des cellules T 4-8.
Protocol
1. Préparation de repos lymphocytes T humains
- Utiliser RosetteSep homme T Cocktail enrichissement cellulaire et de densité moyenne RosetteSep, purifier les cellules T à partir d'échantillons de sang humain selon les instructions du fabricant. La population cellulaire obtenue doit contenir 95% cellules T CD3 + repos. Nous purifions lymphocytes T humains à partir d'échantillons de sang périphérique prélevés sur des volontaires sains en conformité avec le protocole approuvé par le Conseil d'examen interne UC Davis.
- Après isolement, resuspendre lymphocytes T à une densité de 0,5 x 10 6 cellules / mL dans le milieu de culture cellulaire contenant RPMI-1640 avec de la glutamine et l'HEPES, complété avec 10% sérum de veau foetal, de 2% glutamax-I, 1% du RPMI 1640 la vitamine solution, une solution de RPMI 1640% d'acides aminés, le pyruvate de sodium à 1%, et 0,03% β-mercaptoéthanol.
- Suspension cellulaire place dans des flacons de culture cellulaire et de maintenir à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 jusqu'à 24 h avant l'expérience.
2. Préparation de la chambre d'enregistrement
- Les éléments suivants sont nécessaires pour préparer des chambres d'enregistrement: a) de silicium joints toriques, b) rond, 25 mm lamelles nettoyé avec de l'éthanol 70% et distillé H 2 O, c) mélangé Sylgard184, préparé selon les instructions du fabricant, et d) deux 60 x 15 mm boîte de Pétri.
- Placez ~ 0,5 ml de Sylgard184 mélangé dans un plat 60x15 mm Petri.
- Trempez la partie inférieure de l'O-ring dans la pince Sylgard184 aide.
- Retirer l'excès de Sylgard184 le bord de la O-ring en plaçant le joint torique sur une surface propre, comme une autre boîte de Pétri.
- Placez l'anneau sur la lamelle et appuyez vers le bas.
- Guérissez les Sylgard184 par le chauffage des chambres à 85 ° C pendant 40-60 min ou jusqu'à ce que le Sylgard184 est polymérisé.
- Boutique des chambres d'enregistrement dans un conteneur sans poussière.
3. Préparation de pipettes Patch
- Le jour de l'expérience, tirez les pipettes avec un diamètre de l'extrémité ~ 2-um en utilisant capillaires en verre et un extracteur de pipette. Nous utilisons des tubes en borosilicate avec filament (OD: 1,5 mm et ID: 1,10 mm). Pipettes Stocker dans un endroit exempt de poussière.
- Manteau pipette avec Sylgard184 ou revêtement CHIP R6101 Semiconductor protection, selon une procédure standard 9.
- Doucement feu polir les pipettes avant l'expérience.
4. Préparation de configuration patch clamp
- Configurer et sauvegarder les macros pour la formation gigaseal dans le logiciel de contrôle de votre amplificateur de patch-clamp. Nous utilisons un amplificateur EPC-10 pris en charge par Windows XP et le logiciel d'impulsions pour l'acquisition de données. Nous avons fixé le "set-up", "sur la cellule", et "cellule entière" macros selon le manuel d'EPC-10 et les utiliser pour toutes les expériences.
- Préparer des solutions de bain et des solutions pipette énumérés dans le tableau 1 avant l'expérience et les stocker à 4 ° C pendant 1 semaine.
| Produits chimiques | Bain Solutions (mM) | Solutions pipette (mM) | ||
| # 1 | # 2 | # 3 | ||
| CH 3 SO 3 Na | 130 | 110 | 125 | - |
| NaCl | 2 | 4 | 5 | - |
| Ca (OH) 2 | - | 20 | - | - |
| MgCl 2 | 3 | 1 | - | 5 |
| MgSO 4 | - | - | - | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| EDTA | - | - | 1 | - |
| Cs-unespartate | - | - | - | 125 |
| BAPTA | - | - | - | 12 |
| Le glucose | 10 | 10 | 10 | - |
Tableau 1. Solutions pour la cellule entière CRAC enregistrements actuels.
Tous les produits chimiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
- Déterminer les potentiels de jonction liquide (LJ) entre la solution de la pipette de patch et chaque solution 10 de bain. Enregistrer la valeur LJ à l'endroit approprié à l'aide de votre logiciel d'acquisition. Par exemple, dans le programme d'impulsion insérer la valeur LJ en «LJ» de contrôle dans la "amplificateur" fenêtre.
- Configurer et sauvegarder les protocoles de stimulation, comme le montre la figure 1, à l'endroit approprié de votre logiciel d'acquisition, avant les expériences. Dans le programme d'impulsion, nous avons mis le protocole d'acquisition de la «génération d'impulsion" fenêtre.
Figure 1. . Protocole de stimulation rampe de tension de -120 à 100 mV de 50 ms dans la durée est appliqué toutes les 0,2 - 2 s (5 - 0,5 Hz). Potentiel de maintien (V h) entre les rampes est maintenue à 30 mV.
5. Cellules de montage sur la platine du microscope
- Enduire les chambres d'enregistrement avec la poly-L-lysine pour ~ 20 min et laver avec du H 2 O puis avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avant l'étalement des cellules.
- Plate 500 pl de suspension cellulaire contenant 0.2 au 0.5 x10 6 cellules dans la chambre et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
- Fixez la chambre d'enregistrement avec les cellules attachées à un support de chambre. Nous utilisons un porte-chambre de mesure, où la base supporte le bas de la lamelle, tandis que la partie supérieure légèrement en appui sur le haut de la lamelle.
- Placez le porte-chambre sur la scène du microscope inversé.
- Focus sur les cellules en lumière transmise. Nous utilisons un objectif 40X d'huile d'immersion.
- Placer l'électrode de référence Ag / AgCl dans le bain.
- Alignez les multibarrel, système de perfusion par gravité. La pointe du tube d'introduction devrait être placé à un angle de 45 ° à l'étroite lamelle au champ de vue.
- Placez le tuyau d'aspiration en face de l'extrémité du tube entrées.
- Perfuser la chambre avec un tampon phosphate salin (PBS) ou HBSS pour laver les milieux de culture cellulaire et les cellules lâchement.
6. CRAC canaliser les courants d'enregistrement
- Trouver une cellule qui est fermement attaché à la lamelle. Nous choisissent généralement une taille moyenne, de cellules rondes avec une surface extérieure lisse.
- Perfuser la chambre d'enregistrement de Ca 2 + libre, 3 mM de Mg 2 +-solution du bain contenant # 1 (Tableau 1) contenant de 0,5 à 1 thapsigargine pM pour 8-10 min pour bloquer la pompe SERCA. Nous effectuons cette démarche pour épuiser le magasin avant la formation gigaseal.
- En utilisant une microloader Eppendorf et une pipette P-20 de déplacement, remplir la pipette de patch avec la solution pipette (tableau 1) et insérez la pipette de patch dans le porte-pipette sur la headstage amplificateur. Le Ca 2 + chélateur BAPTA est inclus dans la solution passive pipette pour épuiser les stocker et de réduire de Ca 2 +-dépendante l'inactivation du canal CRAC.
- Appliquez une petite quantité de pression positive (~ 3 pouces de H 2 O) à l'intérieur de la pipette de patch avant d'entrer dans le bain. Nous utilisons une sur-mesure à la pression d'aspiration périphérique connecté à l'air comprimé et les lignes de vide pour créer une pression positive ou négative à l'intérieur d'une pipette de patch.
- Basse de la pipette de patch dans le bain sous contrôle visuel via le microscope. Dans le "Oscilloscope" fenêtre, vous devriez voir un courant circulant dans la pipette. Un changement étape comme dans l'amplitude du courant doit être induite par une impulsion de tension de faible amplitude (de test par impulsion) appliquée par la macro prédéfinie. À ce moment, vous devriez être en mesure de déterminer la valeur de la résistance pipette. La résistance de nos pipettes est généralement 5-6 MQ.
- Corriger les «compenser» le potentiel généré entre la pipette et l'électrode de référence.
- Sous contrôle visuel par le biais du microscope, amener la pointe de la pipette rapprocher de la cellule jusqu'à ce qu'elle touche la membrane cellulaire.
- Appliquer une pression négative (20-40 pouces H 2 O) à l'intérieur de la pipette de patch.
- Surveiller la formation gigaseal dans le "oscilloscope" fenêtre. Vous verrez l'amplitude du courant, induite par l'impulsion d'essai, diminue et la valeur de résistance augmente pipette> 5 GQ. Habituellement gigaseal formes au sein d'une few secondes, mais cela peut prendre 1-2 min pour obtenir un gigaseal stable.
- Compenser la capacitance pipette («C-Fast").
- Pause de la membrane de patch en appliquant une pression négative supplémentaires en utilisant une seringue de 20 cc.
- Réglez le potentiel de maintien à +30 mV. Un potentiel de détention positif aide à prévenir les calcium-dépendante l'inactivation du canal CRAC.
- Compenser la capacitance membranaire de la cellule («C-Lent»); enregistrer ou enregistrer la valeur de C-lent.
- Vérifiez la valeur de la résistance d'accès "R s". Dans nos expériences, le s R est généralement de 7 à 20 MQ.
- Commencez à appliquer une série de rampes de tension avec une fréquence de 0,5 Hz (figure 1) dans le Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant # 1. Dans cette solution, le courant CRAC est négligeable par rapport à la "fuite" en cours en raison de la faible perméabilité des canaux CRAC pour Mg 2 +. Enregistrer et utiliser les traces actuelles enregistrées dans la solution de bain n ° 1 dans les analyses futures comme «fuite» des courants. L'amplitude absolue de la "fuite" courant à 100 mV doit être inférieure ou égale à 5 pA. Si la cellule est "fuite", arrêter l'expérience et de recommencer à l'aide d'une pipette nouveau patch et une nouvelle cellule.
- Pour enregistrer Ca 2 + via les canaux CRAC (I Ca-CRAC), remplacer Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant n ° 1 avec 20 mM de 2 Ca solution de bain + contenant # 2 (Tableau 1) par commutation des vannes de perfusion. Cela permet de Ca 2 + au flux via les canaux CRAC et de produire un courant entrant. Dans le "Oscilloscope" fenêtre, vous verrez le développement de rectifier intérieurement I Ca-CRAC (figure 2). L'amplitude du courant à des tensions négatives va continuer à augmenter pendant environ 1 min en raison de la Ca 2 +-dépendante de potentialisation de l'actuelle CRAC.
- Augmenter la fréquence de stimulation avec des rampes de tension à 5 Hz, ce qui est nécessaire pour enregistrer le transitoire courant Na + via les canaux CRAC.
- Remplacer le 20 mM de Ca 2 +-n ° 2 contenant une solution de bain avec Na +-cations divalents contenant une solution sans # 3 (tableau 1) par commutation des vannes de perfusion. Dans le "Oscilloscope" fenêtre, vous verrez un développement transitoires de plus grande amplitude intérieurement rectifier courant Na + via les canaux CRAC (I Na-CRAC; figure 2).
- On peut appliquer 20 mm 2 Ca solution de bain + contenant n ° 2 contenant de 1 à 5 uM La 3 + à la fin de l'expérience d'enregistrer la «fuite» actuel. Cependant, nous n'avons pas trouvé cette approche utile, car la «fuite» des changements en cours dans le temps et il peut devenir plus ou moins à la fin de l'expérience. Nous préférons prendre le courant enregistré dans le Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant n ° 1 au début de l'expérience comme une "fuite" en cours.
- Enregistrer les traces enregistrées en cours d'analyse.
7. Analyse des données
- Récupérer les enregistrements sauvés en cours dans le logiciel d'analyse. Nous utilisons le programme d'impulsion pour analyse.
- Mesurer les amplitudes actuelles au début et à la fin de rampes de tension. Nous généralement mesurer les amplitudes de courant à -100 mV et 100 mV à l'aide de paires de curseurs dans la "Oscilloscope" fenêtre du programme d'impulsion.
- Exporter les valeurs des amplitudes de courant dans un programme graphique pour approfondir l'analyse et la présentation graphique. Nous utilisons des graphiques origine scientifique et logiciels d'analyse, la version 7.
8. Les résultats représentatifs
Figure 2. CRAC courants dans une cellule T humaine de repos. (A), évolution dans le temps des courants CRAC enregistrée dans la cellule entière voltage-clamp de configuration à -100 mV (cercles pleins) et 100 mV (cercles ouverts). Avant la formation gigaseal, la cellule a été pré-incubées pendant 10 min dans ~ Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant n ° 1 contenant 0,5 thapsigargine uM. Après le rodage, les solutions de bain ont été appliqués séquentiellement comme suit: Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant # 1 (0 + 3 Ca Mg), suivie par 20 mM de solution de Ca 2 + bain contenant # 2 (20 Ca), suivie par la solution de bain de cations divalents libres # 3 (DVF), suivie par solution du bain # 2 (20 Ca). La cellule a été stimulé par une série de rampes de tension comme le montre la figure 1. La fréquence de 5 Hz a été rampes en solution de bain # 3 (DVF) et 0,5 Hz dans tous les autres solutions. Notez le lent développement de I Ca-CRAC, après application de 20 mM de Ca 2 +-solution du bain contenant # 2 et le développement rapide aux transitoires du I Na-CRAC en solution de bain DVF # 3. (B), représentant les traces actuelles enregistrées au cours des rampes de tension en Ca 2 + libre 3 mM Mg 2 +-solution du bain contenant # 1 («Fuite»), 20 mM de Ca 2 + solution contenant de bain # 2 (20 Ca), et la solution de bain # 3 (DVF). (C, D), courant-tension des relations de I Ca-CRAC (C) et j'ai Na-CRAC (D) obtenue en soustrayant "fuite" en cours à partir des courants enregistrés au cours des rampes de tension dans 20 mM de Ca 2 +-bain contenant Solution n ° 2 (20 Ca), et la solution de bain # 3 (DVF) montré dans le panneau (B).
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Discussion
L'exploration électrophysiologique des courants de repos CRAC lymphocytes T humains est une tâche difficile parce que le CRAC endogènes d'amplitude en cours dans ces cellules est faible en raison de la taille des cellules de petite taille (diamètre de l'reposant humaine de cellules T est dans la gamme de 5-8 um). Ici, nous présentons une procédure étape par étape pour enregistrer de manière fiable les courants de repos CRAC lymphocytes T humains isolés à partir des cellules mononucléées du sang périphérique. Cette technologie nous permet d'étudier la physiologie et l'expression fonctionnelle des canaux CRAC de lymphocytes T afin de mieux comprendre la nature des réponses normales et pathologiques des cellules immunitaires. En utilisant ce protocole, on peut mesurer des courants dans le CRAC lymphocytes T humains, ainsi que dans d'autres cellules immunitaires, telles que les cellules T activées humaine, les monocytes et les macrophages.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants envers le Département de physiologie et biologie membranaire, Université de Californie à Davis pour nous fournir des installations et un excellent environnement pour les études des canaux ioniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
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- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
