Todo-Cell Gravação de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) Correntes em linfócitos humanos T

Summary

Nós fornecemos um protocolo passo a passo para a gravação de célula inteira patch clamp de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) correntes em sangue periférico mononuclear de células derivadas de linfócitos T humanos.

Abstract

Em linfócitos T, a depleção de Ca ^{2 +} intracelular do Ca ^{2 +} loja leva a ativação de plasmalemmal Ca ^{2 +} canais, chamados de cálcio Release-Activated cálcio (CRAC) canais. CRAC canais desempenham um papel importante na regulação da proliferação de células T e expressão gênica. Função de canal de anormal CRAC nas células T tem sido associada a doenças de imunodeficiência combinada severa e auto-imunes ^{1, 2.} Estudar a função de canal CRAC em células humanas T pode descobrir novos mecanismos moleculares que regulam as respostas imunes normais e desvendar as causas de doenças relacionadas com o humano. Gravações eletrofisiológicas das correntes de membrana uma avaliação mais precisa das propriedades do canal funcional e sua regulamentação. Avaliação eletrofisiológica das correntes CRAC canal em células Jurkat T, um ser humano da leucemia de células T de linha, foi realizado mais de 20 anos atrás ^3, no entanto, as medições atuais CRAC em condições normais de células T humanas permanece uma tarefa desafiadora. As dificuldades na gravação correntes canal CRAC em células T normais são agravados pelo fato de que os linfócitos T derivados do sangue são muito menores em tamanho do que as células T Jurkat e, portanto, o endógeno correntes de célula inteira CRAC são muito baixos em amplitude. Aqui, damos um procedimento passo-a-passo que usam rotineiramente para gravar o Ca ^{2 +} ou Na ⁺ correntes através de canais CRAC em repouso células T humanas isoladas do sangue periférico de voluntários saudáveis. O método descrito aqui foi adotado a partir dos procedimentos utilizados para a gravação das correntes CRAC em células Jurkat T e ativação de células T humanas ^4-8.

Protocol

1. Preparação de repouso Linfócitos T Humanos

1. Usando RosetteSep Humanos Cocktail de Enriquecimento de células T e Medium Density RosetteSep, purificar as células T a partir de amostras de sangue humano de acordo com as instruções do fabricante. A população de células resultante deve conter 95% CD3 ⁺ células T em repouso. Purificamos linfócitos T humanos a partir de amostras coletadas do sangue periférico de voluntários saudáveis, em conformidade com o protocolo aprovado pelo Internal UC Davis Board Review.
2. Após o isolamento, descansando ressuspender as células T com uma densidade de 0,5 x 10 ⁶ células / mL em meio de cultura de células contendo RPMI-1640 meio com glutamina e HEPES, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2% Glutamax-I, 1% RPMI 1640 vitamina solução, 1% solução de RPMI 1640 aminoácidos, piruvato de sódio a 1%, e 0,03% β-mercaptoetanol.
3. Suspensão lugar célula em frascos de cultura de células e manter a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO ₂ para até 24 h antes do experimento.

2. Preparação da Câmara de gravação

1. A seguir são necessários para preparar as câmaras de gravação: a) de silício O-rings, b) redondo, 25 mm lamínulas limpos com álcool 70% e destilada H ₂ O, c) mista Sylgard184, preparados de acordo com as instruções do fabricante, e d) dois 60 x 15 mm placas de Petri.
2. Coloque ~ 0,5 mL de Sylgard184 misturado em uma placa de Petri 60x15 mm.
3. Mergulhe a parte inferior do O-ring para o forceps Sylgard184 usando.
4. Retire o excesso de Sylgard184 da borda do anel, colocando-o O-ring em uma superfície limpa, como uma outra placa de Petri.
5. Coloque o anel sobre a lamínula e pressione-o para baixo.
6. Curar a Sylgard184 pelo aquecimento das câmaras a 85 ° C por 40-60 min ou até que o Sylgard184 é polimerizado.
7. Armazenar as câmaras de gravação em um recipiente de pó.

3. Preparação de Pipetas patch

1. No dia do experimento, puxe pipetas com um diâmetro da ponta ~ 2 mícrons usando capilares de vidro e um puxador de pipeta. Usamos tubos de borosilicato com filamento (OD: 1,5 mm e ID: 1.10 mm). Pipetas loja em um local livre de poeira.
2. Brasão da pipeta pontas com Sylgard184 ou revestimento Semiconductor Hipec R6101 de proteção, de acordo com um procedimento padrão ^9.
3. Suavemente-fogo polonês as pipetas antes do experimento.

4. Remendo Preparação Setup Grampo

1. Configurar e salvar as macros para a formação gigaseal no software de controle de seu amplificador de patch-clamp. Nós usamos um amplificador EPC-10 suportados pelo Windows XP e software de pulso para a aquisição de dados. Vamos definir o "set-up", "na célula", e "todo-cell" macros de acordo com o manual de EPC-10 e usá-las para todos os experimentos.
2. Preparar soluções de banho e soluções pipeta listadas na Tabela 1 antes do experimento e armazená-los a 4 ° C por até 1 semana.

Produtos químicos	Soluções de banho (mM)			Pipeta Solutions (mM)
	# 1	# 2	# 3
CH 3 SO 3 Na	130	110	125	-
NaCl	2	4	5	-
Ca (OH) 2	-	20	-	-
MgCl 2	3	1	-	5
MgSO 4	-	-	-	2
HEPES	10	10	10	15
HEDTA	-		10	-
EDTA	-	-	1	-
Cs-aspartate	-	-	-	125
BAPTA	-	-	-	12
Glicose	10	10	10	-

Tabela 1. Soluções para toda célula CARC gravações atuais.

Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.

3. Determinar potenciais de junção líquida (LJ) entre a solução de pipeta patch e cada solução de banho de ^10. Salvar o valor LJ no local apropriado utilizar o seu software de aquisição. Por exemplo, no programa Pulso inserir o valor LJ em "LJ" no controle "amplificador" janela.
4. Configurar e salvar os protocolos de estimulação, como mostrado na Figura 1, no local apropriado do seu software de aquisição antes dos experimentos. No programa Pulse, vamos definir o protocolo de aquisição na "Geração Pulse" janela.
   
   Figura 1. . Protocolo de estimulação Rampa de tensão de -120 a +100 mV de 50 ms de duração é aplicado a cada 0,2-2 s (5-0,5 Hz). Potencial de exploração (V _h) entre rampas é mantida em 30 mV.

5. As células de montagem no Palco Microscópio

1. Revestimento das câmaras de gravação com _{poli-L-lisina} para ~ 20 minutos e lave com H ₂ O e depois com solução salina balanceada de Hank (HBSS) antes do plaqueamento das células.
2. ML placa de 500 de suspensão de células contendo 0,2-0,5 x10 ⁶ células na câmara e incubar por 20 min a 37 ° C.
3. Segura a câmara de gravação com as células anexado em um suporte de câmara. Usamos um suporte de câmara custom-made, onde a base de suporte na parte inferior da lamela, enquanto a parte de cima delicadamente pressiona contra a parte superior da lamínula.
4. Coloque o suporte da câmara no palco do microscópio invertido.
5. Foco sobre as células em luz transmitida. Nós usamos uma objetiva de imersão 40X de petróleo.
6. Coloque o eletrodo de referência Ag / AgCl para o banho.
7. Alinhar o multibarrel, sistema de perfusão gravidade-driven. A ponta do tubo de entrada deve ser colocado em um ângulo de 45 ° até o fim lamela para o campo de visão.
8. Posicione o tubo de sucção em frente à ponta do tubo de entrada.
9. Perfundir a câmara com tampão fosfato (PBS) ou HBSS para lavar os meios de cultura celular e células frouxamente ligados.

6. CRAC Canal Gravação Correntes

1. Encontrar uma célula que está firmemente ligado à lamela. Nós geralmente seleciona uma média de tamanho de célula, redonda com uma superfície lisa exterior.
2. Perfundir da câmara gravando com Ca ^{2 +} livre, 3 mM Mg ^{2 +} solução de banho contendo # 1 (Tabela 1) contendo 0,5-1 tapsigargina M para 80-10 min para bloquear a bomba SERCA. Realizamos este passo para empobrecem a loja antes da formação gigaseal.
3. Usando um microloader Eppendorf e um P-20 pipeta deslocamento, encher a pipeta patch com a solução da pipeta (Tabela 1) e inserir a pipeta patch para o titular pipeta na headstage amplificador. O Ca ^{2 +} quelante BAPTA está incluído na solução de pipeta para passivamente empobrecem a loja e para reduzir o Ca ^{2 +} dependentes de inativação do canal CRAC.
4. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva (~ 3 cm de H ₂ O) no interior da pipeta de patch antes de entrar no banho. Nós usamos um dispositivo feito sob medida de pressão de sucção conectado ao ar pressurizado e linhas de vácuo para criar uma pressão positiva ou negativa dentro de uma pipeta patch.
5. Inferior da pipeta patch para o banho sob controle visual através do microscópio. No "Osciloscópio" janela, você deve ver uma corrente que flui através da pipeta. A mudança de patamar-como na amplitude da corrente deve ser induzido por um pulso de pequena amplitude da tensão (teste de pulso), aplicadas pela macro predefinida. Neste momento, você deve ser capaz de determinar o valor da resistência da pipeta. A resistência de nosso pipetas é tipicamente 5-6 mohms.
6. Corrigir o "offset" potencial gerado entre a pipeta eo eletrodo de referência.
7. Sob controle visual através do microscópio, traga a ponta da pipeta mais próximo da célula até tocar a membrana celular.
8. Aplicar pressão negativa (20-40 polegadas de H ₂ O) no interior da pipeta patch.
9. Monitorar a formação gigaseal no "osciloscópio" janela. Você vai ver a amplitude da corrente, induzido pelo pulso de teste, diminui e aumenta o valor da resistência pipeta> 5 GÊ. Formas normalmente gigaseal dentro de um fesegundo w, mas pode demorar 1-2 minutos para conseguir um gigaseal estável.
10. Compensar a capacitância pipeta ("C-Fast").
11. Ruptura da membrana correção através da aplicação de pressão negativa adicional, usando uma seringa de 20 cc.
12. Definir o potencial de exploração para 30 mV. Um potencial de detenção positivo ajuda a prevenir cálcio-dependente inativação do canal CRAC.
13. Compensar a capacitância da membrana da célula ("C-slow"); salvar ou gravar o valor de C-lenta.
14. Verificar o valor da resistência de acesso "R _s". Em nossos experimentos, o _s R é tipicamente 70-20 mohms.
15. Começar a aplicar uma série de rampas de tensão com uma freqüência de 0,5 Hz (Figura 1) em Ca ^{2 +} livre mM 3 Mg ^{2 +} solução de banho contendo o 1 º. Nesta solução, atual CRAC é pequeno em comparação com o "vazamento" de corrente devido à pouca permeabilidade dos canais CRAC para Mg ^{2 +.} Salvar e usar os traços atuais gravadas em solução de banho # 1 em análises futuras como "vazamento" das correntes. A amplitude absoluta do "vazamento" corrente a -100 mV deve ser menor ou igual a 5 pA. Se a célula é "furado", interromper a experiência e começar de novo com uma pipeta de novo adesivo e uma nova célula.
16. Para gravar Ca ^{2 +} através de canais atuais CRAC (I _Ca-CRAC), substituir Ca ^{2 +} livre 3 mM Mg ^{2 +} solução de banho contendo # 1 com 20 mM Ca ^{2 +} contendo solução de banho # 2 (Tabela 1), alternando as válvulas de perfusão. Isto permite Ca ^{2 +} a fluir através de canais de CRAC e produzir uma corrente dentro. No "Osciloscópio" janela, você verá o desenvolvimento de retificar interiormente eu _Ca-CRAC (Figura 2). A amplitude da corrente com tensões negativas continuará a aumentar para cerca de 1 min, devido ao Ca ^{2 +} dependentes de potenciação da corrente CRAC.
17. Aumentar a freqüência de estimulação com rampas de tensão para 5 Hz, que é necessário para gravar o Na ⁺ transitória atuais através de canais CRAC.
18. Substituir os 20 mM Ca ^{2 +} contendo solução de banho # 2 com Na ^+-ção contendo solução livre de bivalentes # 3 (Tabela 1), alternando as válvulas de perfusão. No "Osciloscópio" janela, você verá um desenvolvimento transitório de maior amplitude dentro retificar Na ⁺ atual através dos canais CRAC (I _Na-CRAC; Figura 2).
19. Pode-se aplicar 20 mM Ca ^{2 +} contendo solução de banho # 2 contendo 1-5 mM La ^{3 +,} no final do experimento para gravar o "vazamento" atual. No entanto, não encontramos essa abordagem útil porque o "vazamento" mudanças em curso ao longo do tempo e pode se tornar maior ou menor no final do experimento. Nós preferimos tomar a atual registrado no Ca ^{2 +} livre mM 3 Mg ^{2 +} contendo solução de banho de # 1 no início do experimento como uma "fuga" atual.
20. Guardar os vestígios gravados atual para posterior análise.

7. Análise de Dados

1. Recuperar os registros salvos atual em software de análise. Usamos o programa de pulso para análise.
2. Medir a amplitude atual no início e no final das rampas de tensão. Normalmente, medir a amplitude atual em -100 mV e em 100 mV usando pares de cursores no "Osciloscópio" janela do programa Pulse.
3. Exportar os valores de amplitudes atual em um programa gráfico para posterior análise e apresentação gráfica. Usamos Graphing Origem Científica e Software Análise, versão 7.

8. Resultados representante

Figura 2. Correntes CRAC em uma célula T humano descansando. (A), o curso Tempo de correntes CRAC registrados em todo o celular de configuração de voltagem clamp-a -100 mV (círculos cheios) e 100 mV (círculos abertos). Antes da formação gigaseal, a célula foi pré-incubado por ~ 10 min em Ca ^{2 +} livre mM 3 Mg ^{2 +} contendo solução de banho # 1 contendo 0,5 mM tapsigargina. Após invasão, soluções de banho foram seqüencialmente aplicados da seguinte forma: Ca ^{2 +} livre 3 mM Mg ^{2 +} contendo solução de banho # 1 (0 Ca + Mg 3), seguido por 20 mM Ca ^{2 +} solução de banho contendo # 2 (20 Ca), seguido por divalente-cação solução livre de banho # 3 (DVF), seguido pela solução de banho # 2 (20 Ca). A célula foi estimulado com uma série de rampas de tensão, como mostrado na Figura 1. A freqüência de rampas foi de 5 Hz em solução de banho # 3 (DVF) e 0,5 Hz em todas as outras soluções. Observe o lento desenvolvimento de I _Ca-CRAC após a aplicação de 20 mM Ca ^{2 +} contendo solução de banho # 2 eo rápido desenvolvimento transitória da I _Na-CRAC na DVF solução de banho # 3. (B), Representante traços corrente registou durante rampas de tensão em Ca ^{2 +} livre 3 mM Mg ^{2 +} solução de banho contendo # 1 ("Vazamento"), 20 mM Ca ^{2 +} contendo solução de banho # 2 (20 Ca), e uma solução de banho # 3 (DVF). (C, D), atual tensão relações de I _Ca-CRAC (C) e eu _Na-CRAC (D) obtida subtraindo-se "vazar" atual das correntes registradas durante tensão rampas em 20 mM Ca ^{2 +} contendo banho solução # 2 (20 Ca), e uma solução de banho # 3 (DVF) mostrado no painel (B).

Discussion

A investigação eletrofisiológicos de correntes CRAC em repouso células T humanas é uma tarefa desafiadora, porque a amplitude CRAC de corrente endógena dessas células é pequeno devido ao tamanho de pequenas células (o diâmetro de células T humanas em repouso está na faixa de 5-8 mm). Aqui, apresentamos um procedimento passo-a-passo para registro confiável correntes CRAC em repouso linfócitos T humanas isoladas a partir de células mononucleares do sangue periférico. Esta tecnologia permite-nos investigar a fisiologia e expressão funcional de canais CRAC em repouso células T para melhor compreender a natureza do normal e patológico respostas imunológicas das células. Usando este protocolo, pode-se medir correntes CRAC em repouso células T humanos, bem como em outras células do sistema imunológico, tais como a ativação de células T humanas, monócitos e macrófagos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15061
RosetteSep Density Medium	Stem Cell Technologies	15705
RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES	Fisher Scientific	SH3025501
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
GlutaMAX-I (100X solution)	Invitrogen	35050
RPMI 1640 vitamin solution (100X)	Sigma-Aldrich	7256
1640 amino acids solution (50X)	Sigma-Aldrich	R7131
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
β-Mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Inositol trisphosphate	Sigma-Aldrich	19766
BAPTA	Sigma-Aldrich	A4926
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636
Lanthanum Chloride	Sigma-Aldrich	262072
Thapsigargin	Calbiochem	586005
Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004
HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating	Dow Corning
63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table	Technical Manufacturing Corp.	63-540
EPC 10 patch clamp amplifier with headstage	HEKA Instruments
Micromanipulator	Sutter Instrument Co.	MP-285
Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective	Olympus Corporation	1X71
Windows Computer	Dell
Pulse software	HEKA Instruments
Origin Scientific Graphing and Analysis Software	OriginLab
Patch pipette puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm	Sutter Instrument Co.	BF150-110-7.5
Narashige’s Microforge	Tritech Research, Inc.	MF-830
Silicon O-rings	McMaster-Carr	111 S70
Coverslips 25 mm	Fisher Scientific	12-545-102 25 mm 25CIR.-1