Summary
Biz, Kalsiyum-Film Aktive Kalsiyum tam hücreli yama kelepçe kayıt (Kerek) periferik kan mononükleer hücre-kökenli insan T lenfositleri akımları için bir adım-adım protokolü sağlar.
Abstract
T lenfositleri, tükenmesi Ca 2 + hücre içi Ca 2 + mağaza, aktivasyonu plasmalemmal Ca 2 + kanallarını açar, Kalsiyum Yayın-Aktif Kalsiyum (Kerek) kanalları olarak adlandırılır . Kerek kanal T hücre proliferasyonu ve gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli rol oynar. T hücreleri anormal Kerek kanal fonksiyonu ağır kombine immün yetmezlik ve otoimmün hastalıklar 1, 2 bağlantılı olmuştur. Insan T hücreleri Kerek kanal fonksiyonu incelenmesi, normal immün yanıtları düzenleyen yeni moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak ve ilgili insan hastalıklarının nedenleri çözmek olabilir. Membran akımlarının Elektrofizyolojik kayıtları, işlevsel kanal özellikler ve bunların yönetmelik en doğru değerlendirme sağlar. Jurkat T hücreleri, bir insan lösemi T hücre hattı Kerek kanal akımlarının Elektrofizyolojik değerlendirme ilk 3 daha 20 yıl önce yapıldı, ancak, normal insan T hücreleri Kerek akım ölçümleri zorlu bir görev olarak durmaktadır. Kan kaynaklı T lenfositleri Jurkat T hücrelerinin daha boyutu çok daha küçük ve bu nedenle, endojen tam hücreli Kerek akımların genliği çok düşük olduğu gerçeği ile normal T hücreleri Kerek kanal akımları kayıt zorluklar ekleniyor. Burada, biz, biz rutin olarak kaydetmek için kullanabileceğiniz Ca 2 + veya Na + insan T hücrelerinin sağlıklı gönüllülerin periferik kandan izole edilen dinlenme Kerek kanalları üzerinden akımlar. Bir adım-adım prosedürü vermek Burada anlatılan yöntemi, Jurkat T hücreleri Kerek akımları kayıt ve insan T hücrelerinin 4-8 aktive için kullanılan usuller kabul edilmiştir .
Protocol
1. Dinlenme İnsan T Lenfositler hazırlanması
- RosetteSep İnsan T Hücre Zenginleştirme Kokteyl ve RosetteSep Yoğunluk Orta kullanarak, üreticinin talimatlarına göre insan kanı örnekleri T hücreleri arındırmak. Ortaya çıkan hücre nüfusun% 95 CD3 + dinlenme T hücreleri içermelidir. Biz insan T lenfositleri sağlıklı gönüllülerin UC Davis İç Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanan protokol uyarınca alınan periferik kan örnekleri arındırmak.
- Izolasyondan sonra,% 10 fetal buzağı serumu,% 2 GlutaMAX-I,% 1 RPMI 1640 ile desteklenmiş, glutamin ve Hepes RPMI-1640 ortamı içeren hücre kültür ortamında 0.5 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu dinlenme T hücreleri tekrar süspansiyon vitamin çözeltisi,% 1 RPMI 1640 amino asitler çözüm,% 1 sodyum piruvat, ve% 0.03 β-mercaptoethanol.
- Place hücre hücre kültürü şişeler içine süspansiyon ve 37 ° C nemlendirilmiş bir inkübatör% 5 CO 2 ile 24 saat kadar önce deneme için korumak.
2. Kayıt Odası hazırlanması
- Aşağıdaki kayıt odaları hazırlaması gerekli:) b, a) silikon O-halkalar yuvarlak,% 70 etanol ve distile H 2 O, c ile temizlenmelidir 25 mm lamelleri), Sylgard184 karışık üreticinin talimatlarına göre hazırlanan, ve d) iki adet 60 x 15 mm Petri kapları.
- Yeri ~ 60x15 mm Petri kabında 0,5 mL içine karışık Sylgard184.
- O-ring alt kısmında Sylgard184 kullanarak forseps içine batırın.
- O-ring koyarak başka bir Petri kabı temiz bir yüzey, O-ring kenarına aşırı Sylgard184 çıkarın.
- Halka lamel üzerine yerleştirin ve aşağı doğru bastırın.
- 85 ° C 40-60 dk ya Sylgard184 kadar polimerize odaları ısıtarak Sylgard184 Cure.
- Kayıt odaları tozsuz bir kapta saklayın.
3. Patch Pipetler hazırlanması
- Deney günü, cam kapiller ve bir pipet çektirmenin kullanarak bir ~ 2-mikron ucu çapı pipetler çekin. Biz filament (1.5 mm ve ID: 1.10 mm OD) ile borosilikat tüp kullanın. Tozsuz bir yerde saklayın pipetler.
- Standart bir prosedür 9 göre Sylgard184 veya HIPEC R6101 Semiconductor Koruyucu Kaplama Coat pipet ipuçları.
- Deneyden önce hafifçe pipetler yangın lehçe.
4. Patch Kelepçe Kurulum Hazırlığı
- Patch-klemp amplifikatör kontrol yazılımı gigaseal oluşumu için makroları yapılandırma ve kaydedin. Biz Windows XP ve veri toplama için nabız yazılım tarafından desteklenen bir EPC-10 amplifikatör kullanır. EPC-10 kılavuzuna göre, "hücre" ve "tam hücreli" makrolar "set-up" ayarlayın ve tüm deneyler için bunları kullanmak.
- Deneme öncesinde banyo çözümleri ve Tablo 1'de yer alan pipet çözümleri hazırlayın ve 1 hafta kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın.
| Kimyasallar | Banyo Çözümleri (mM) | Pipet Çözümleri (mM) | ||
| # 1 | # 2 | # 3 | ||
| CH 3 SO 3 Na | 130 | 110 | 125 | - |
| NaCl | 2 | 4 | 5 | - |
| Ca (OH) 2 | - | 20 | - | - |
| MgCl 2 | 3 | 1 | - | 5 |
| MgSO 4 | - | - | - | 2 |
| Hepes | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| EDTA | - | - | 1 | - |
| Cs-spartate | - | - | - | 125 |
| BAPTA | - | - | - | 12 |
| Glikoz | 10 | 10 | 10 | - |
Tablo 1. Tam hücreli Carc mevcut kayıtları için çözümler.
Bütün kimyasallar Sigma-Aldrich, St Louis, MO satın alınmıştır.
- Yama pipet çözüm ve her banyo çözümü 10 arasında sıvı birleşme potansiyelleri (LJ) belirleyin. LJ değeri satın alma yazılımı kullanarak uygun bir yere kaydedin. Örneğin, Darbe programı "Amplifikatör" penceresinde "LJ" kontrol LJ değerini yerleştirin.
- Şekil 1'de gösterildiği gibi deneyler önce satın alma yazılımı uygun yerde stimülasyon protokolleri, yapılandırma ve kaydedin. Darbe programında, "Darbe Üretimi" penceresinde satın alma protokolü ayarlayın.
Şekil 1. Uyarım protokolü -120 süresi 50 ms +100 mV Gerilim rampası her 0.2 - 2 (5 - 0,5 Hz) uygulanır. Rampaları arasındaki Holding potansiyel (V s) +30 mV korunur.
5. Mikroskop Sahne Montaj Hücreler
- Hücreleri kaplama önce sonra ~ 20 dakika ve yıkama ve H 2 O ile Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS), poli-L-lizin ile Coat kayıt odaları .
- 37 odası ve 20 dakika boyunca inkübe 0.2-0.5 x10 6 hücre içeren hücre süspansiyonu Plaka 500 mcL ° C
- Bir oda sahibinin bağlı hücreleri ile kayıt odasında sabitleyin. Biz özel yapılmış bir odasının taban lamel alt destekler tutucu, lamel üst karşı üst kısmı hafifçe presler.
- Inverted mikroskop sahnede oda sahibinin yerleştirin.
- Iletilen ışık hücreleri üzerinde odaklanın. Biz 40X immersiyon yağı hedefi kullanın.
- Ag / AgCl referans elektrot banyo içine yerleştirin.
- Multibarrel, yerçekimine bağlı perfüzyon sistemi hizalayın. Girişinin tüpünün ucu, 45 derecelik bir açıyla görüş alanı lamel yakın yerleştirilmelidir.
- Girişi tüp ucu karşısında emme borusu yerleştirin.
- Odasına serpmek fosfat tamponlu salin (PBS) veya HBSS hücre kültürü medya ve gevşek bağlı hücreleri yıkayacak.
6. Kerek Kanal Kayıt Akımlar
- Lamel sıkıca bağlı bir hücre. Biz genellikle pürüzsüz bir dış yüzeye sahip ortalama büyüklükteki bir yuvarlak hücre seçin.
- Ca 2 +-free, 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözüm SERCA pompa engellemek için 8-10 dakika süreyle 0.5-1 mcM thapsigargin içeren # 1 (Tablo 1) ile kayıt odasında serpmek. Biz mağaza gigaseal oluşumu öncesinde tüketmek için bu adımı gerçekleştirmeniz.
- Eppendorf Microloader ve P-20 pipeti kullanarak, yama pipet pipet çözüm (Tablo 1) ile doldurun ve amplifikatör headstage pipet tutucu içine yama pipet yerleştirin. Ca 2 + şelasyon BAPTA pasif mağaza tüketmek ve Ca 2 +-bağımlı Kerek kanal inaktivasyon azaltmak için pipet çözümü yer almaktadır.
- Banyo yama pipet içine girmeden önce küçük bir miktar pozitif basınç (H 2 O ~ 3 inç) uygulayın. Biz bir yama pipet içinde pozitif veya negatif basınç oluşturmak için basınçlı hava ve vakum hatları bağlı bir ölçüye göre basınç emme aygıtı kullanın.
- Mikroskop üzerinden görsel kontrol altında banyoya yama pipet indirin. "Osiloskop" penceresinde, geçerli bir pipet akan göreceksiniz. Geçerli genliği bir adım gibi değişiklik, önceden ayarlanmış makro tarafından uygulanan küçük bir genlik gerilim darbesi (test pulse) tarafından indüklenen olmalıdır. Şu anda, pipet direnç değeri belirlemek mümkün olmalıdır. Bizim pipetler direnç genellikle M 5-6.
- Pipet ve referans elektrot arasında oluşturulan "offset" potansiyel düzeltin.
- Hücre zarının dokunana kadar mikroskop üzerinden görsel denetimi altında, yakın hücreye pipet getirmek.
- Yama pipet içinde negatif basınç (H 2 O, 20-40 inç) uygulayın.
- "Osiloskop" penceresinde gigaseal oluşumu izleyin. Test darbe> 5 GΩ pipet direnci artar, azalır ve değeri ile indüklenen akımın genliği, göreceksiniz. Genellikle fe içinde gigaseal formlarıw saniye, ama istikrarlı bir gigaseal elde etmek için 1-2 dakika sürebilir.
- Pipet kapasitans ("C-Hızlı") giderin.
- 20 cc şırınga kullanarak ek negatif basınç uygulayarak yama membran kırın.
- +30 MV tutma potansiyeli ayarlayın. Olumlu bir tutma potansiyeli kalsiyum-bağımlı Kerek kanal inaktivasyon önlemeye yardımcı olur.
- ("C-yavaş"), hücre zarının kapasitans telafi C-yavaş değeri kaydetmek veya kayıt.
- "R" erişim direnç değerini kontrol edin. Deneylerde, Ar-ler genellikle M 7-20.
- (Şekil 1), Ca 2 + 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözüm # 1 0,5 Hz frekans ile gerilim rampaları bir dizi uygulamaya başlayın . Bu çözüm, Mg 2 + Kerek kanalları yoksul geçirgenliği nedeniyle "kaçak" akım ile karşılaştırıldığında Kerek akım yok denecek kadar küçük. Kaydedin ve "kaçak" akımları olarak gelecekteki analizlerde banyo çözüm # 1 kaydedilen mevcut izleri kullanabilirsiniz. -100 MV "kaçak" geçerli mutlak genlik 5 pA eşit veya daha az olmalıdır. Hücreli "sızdıran" ise, yeni bir yama pipet ve yeni bir hücre kullanarak üzerinde deney ve başlangıç durdurun.
- Kerek kanalları (I Ca-Kerek) ile Ca 2 + cari kayıt için perfüzyon vanaları geçiş Ca 2 + ücretsiz 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözüm # 1 20 mM Ca 2 + içeren banyo çözüm # 2 (Tablo 1) ile değiştirin. Bu Ca 2 + Kerek kanallar üzerinden akış sağlar ve içe doğru bir akım üretmek. "Osiloskop" penceresinde, içsel ben Ca-Kerek (Şekil 2) giderilmesi gelişimini göreceksiniz. Negatif voltaj seviyelerinde geçerli genliği, Ca 2 +-bağımlı potansiyasyonu Kerek akımı nedeniyle yaklaşık 1 dakika artmaya devam edecek .
- Kerek kanallar aracılığıyla geçici Na + cari kayıt için gerekli olan 5 Hz gerilim rampaları ile stimülasyon frekans artırın.
- 20 mM değiştirin Ca 2 +-perfüzyon vanaları geçiş içeren banyo çözüm # 2 Na +-kalsiyum katyon içeren ücretsiz bir çözüm # 3 (Tablo 1). "Osiloskop" penceresinde, içsel Na giderilmesi büyük genlik geçici bir gelişme göreceksiniz + Akım Kerek kanalları (I Na-Kerek; Şekil 2) ile.
- Bir 20 mM Ca 2 "kaçak" geçerli kaydetmek için deney sonunda 1-5 mcM La 3 + + içeren banyo çözümü içeren # 2 başvurabilir. Ancak, zaman içinde "kaçak" güncel değişiklikler nedeniyle bu yaklaşım yararlı vermedi ve bu deney sonunda daha büyük veya daha küçük olabilir. Ca 2 kaydedilen cari + ücretsiz 3 mM Mg 2 + içeren bir "kaçak" akım olarak deney başında banyo çözüm # 1 almayı tercih
- Daha fazla analiz için kaydedilen akım izleri kaydedin.
7. Veri Analizi
- Analiz yazılımı içine kaydedilen kayıtları almak. Biz analiz için Darbe programı kullanabilirsiniz.
- Gerilim rampaların başında ve sonunda mevcut genlikleri ölçün. Biz genellikle, -100 mV ve 100 mV Darbe programı "Osiloskop" penceresinde imleçler çiftleri kullanarak mevcut genlikleri ölçer.
- İhracat, mevcut genlikleri değerleri daha fazla analiz ve grafik sunumu için bir grafik programı içine. Biz Kökeni Bilimsel Grafik ve Analiz Yazılımı, sürüm 7 kullanın.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 2. Dinlenme insan T hücre Kerek akımları (A), -100 mV (dolu daireler) ve 100 mV (açık daireler) tüm hücre voltaj-klemp yapılandırma kaydedilen Kerek akımların Zaman kursu . Gigaseal oluşumuna önce, hücre Ca 2 ~ 10 dakika için preinkübe + ücretsiz 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözümü # 1 - 0.5 mcM thapsigargin içeren Break-sonra, banyo çözümleri sırayla şu şekilde uygulanmıştır: Ca 2 + 3 mM 2 Mg, Ca 2 + içeren banyo çözümü # 2, 20 mM tarafından takip + içeren banyo çözümü # 1 (0 Ca + Mg 3 ), (20 Ca), banyo çözüm # 2 (20 Ca) tarafından takip kalsiyum katyon-banyo çözümü # 3 (DVF) izledi. Hücre Şekil 1'de gösterildiği gibi voltaj rampaları bir dizi ile uyarıldı. Rampa banyo çözüm # 3 (DVF) ve diğer tüm çözümler 0,5 Hz frekans 5 Hz. 20 mM Ca 2 + içeren banyo çözümü # 2 ve Na-Kerek hızlı geçici kalkınma DVF banyo çözüm # 3 uygulamadan sonra yavaş bir gelişme Not I Ca-Kerek . (B), Temsilci akım izleri + ücretsiz 3 mM Mg 2 + içeren banyo çözüm # 1 (Ca 2 gerilim rampaları sırasında kaydedilen"Kaçak"), 20 mM Ca 2 + içeren banyo çözüm # 2 (20 Ca) ve banyo çözümü # 3 (DVF). (C, D), Ca-Kerek (C) ve I Na-Kerek (D) Akım-gerilim ilişkileri voltaj rampaları sırasında 20 mM Ca 2 + içeren banyo kaydedildi akımları "kaçak" mevcut çıkarılarak elde edilen Çözüm # 2 (20 Ca) ve banyo çözümü panelinde gösterilen # 3 (DVF) (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insan T hücrelerinin dinlenme Kerek akımların elektrofizyolojik soruşturma, bu hücrelerin endojen Kerek geçerli genliği küçük hücre boyutunu (dinlenme insan T hücre çapı 5-8 mm aralığında) nedeniyle küçük olduğu için zor bir iştir. Burada, periferik kan mononükleer hücreleri izole dinlenme insan T lenfositleri güvenilir Kerek akımları kaydetmek için bir adım-adım prosedürü sunuyoruz. Bu teknoloji bize daha normal ve patolojik immün hücre yanıtlarını doğasını anlamak için dinlenme T hücreleri Kerek kanal fizyolojisi ve fonksiyonel ifade araştırmak için izin verir. Bu protokolü kullanarak, bir insan T hücrelerinin yanı sıra aktive olmuş insan T hücreleri, monositler ve makrofajlar gibi diğer bağışıklık hücrelerini, dinlenme halindeki Kerek akımları ölçebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz tesisleri ve iyon kanalları çalışmaları için mükemmel bir ortam sağlamak için Fizyoloji Anabilim Dalı ve Membran Biyoloji, University of California Davis müteşekkiriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen | 35050 | |
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Windows Computer | Dell | ||
| Pulse software | HEKA Instruments | ||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab | ||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Silicon O-rings | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
