Summary
Данная статья описывает быстрый протокол эффективно изолировать мононуклеарных клеток из головного и спинного мозга ткани, которые могут быть эффективно использованы для проточной цитометрии анализа.
Abstract
Выделение иммунные клетки, которые проникают в центральную нервную систему (ЦНС), во время инфекции, травмы, аутоиммунные заболевания или нейродегенерации, часто требуется, чтобы определить их фенотип и эффекторные функции. Гистохимические подходы играют важную роль для определения расположения проникновения клеток и исследованы соответствующие патологии ЦНС. Тем не менее, на месте гистохимии и иммунофлуоресцентного методы окраски ограничено количество антител, которые могут быть использованы за один раз, чтобы характеризовать иммунную подтипов ячейку в определенной ткани. Таким образом, гистологические подходов в сочетании с иммунной фенотипирование методом проточной цитометрии имеют решающее значение для полного описания состава местной инфильтрационной ЦНС. Этот протокол основан на разделении ЦНС сотовой надстройки над discontinous Перколла градиентов. Данная статья описывает быстрый протокол эффективно изолировать мононуклеарных клеток из головного и спинного мозга ткани, которые могут быть эффективно использованы для идентификации различных иммунных клеточных популяций в одном образце с помощью проточной цитометрии.
Protocol
Подготовка реагентов
Подготовка акции изотонический Перколла (SIP), 4 мл на мозг, путем смешивания 9 частей Перколла с одной частью 10X HBSS без Ca + + и Mg + +.
Подготовка SIP на 70% в 1X HBSS без Ca + + и Mg + +, 2 мл на мозг обойтись в 15 мл полипропилен конической трубе.
Примечание: Рекомендуется, чтобы Перколла должны использоваться при комнатной температуре, если они используются холодные, клетки имеют тенденцию группироваться и сотовый разделение менее эффективным.
Коллекция тканей и гомогенизации
Обезболить мышей и заливать через левый желудочек с ледяной 1X HBSS. Рассеките головной и спинной мозг и поддерживать в RPMI без фенола красного, пока все мыши были принесены в жертву.
Место тканей в 7 или 15 мл Dounce гомогенизатор, содержащий 3 мл RPMI, мягко сделать клеточной суспензии с свободную установку пестиком (размер), а затем Тай облегающие пестиком (B размера) в целях дальнейшего диссоциируют тканей. Полный объем клеточные суспензии до 7 мл RPMI.
Градиент создана
Добавьте 3 мл SIP к клеточной суспензии, чтобы сделать окончательные 30% SIP
Медленно слой 10 мл клеточной суспензии в верхней части 70% SIP. Это наиболее критический этап процедуры, используйте пипетку-аппарат установлен в гравитационном режиме избежать смешивания 70% и 30% растворы. Очень четко плоская линия должна быть видна на 70% -30% узел.
Центрифуга 30 минут при 500G 18 ° C. Убедитесь, что центрифуга остановится с минимальным или вообще не тормозить так, что межфазные не нарушается.
Использование передачи пипетки, аккуратно снимите слой мусора из верхней части трубки и собрать 2,0-3,0 мл 70% -30% межфазной в чистую коническую трубку с 8 мл 1X HBSS. Убедитесь, что Перколла содержащие межфазной разбавляют примерно в три раза, перемешать несколько раз инверсии и centrifugre 7 мин при 500G при 18 ° C.
Ресуспендируют гранул в 1 мл клеточной буфера окрашивания и перенести его на 1,5 мл трубки и промыть еще один раз, используя микро-центрифуге при 10000 G 1 мин при 4 ° C.
Антитела окрашивание
Ресуспендируют гранул в 50 мкл очищенной antimouse CD16/CD32 разбавленной 1:200 в ячейке буфера окрашивания блокировать Fc сайты связывания. Инкубируйте со льдом в течение 10 мин. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
Добавить 50 мкл антител смешивать коктейль, а затем инкубируют на льду в течение 30 мин. Каждое антитело должно быть сначала титровали для оценки оптимального разведения. Используйте соответствующие флуорохромом комбинаций выбирается в зависимости возможностей лазерной и настройки фильтров от конкретной цитометр потока.
Вымойте клетки в ячейке окрашивания буфера, ресуспендируют гранулы в 100-200 мкл клеточной буфера окрашивания и анализа непосредственно в цитометр, или же клетки могут быть ресуспендировали в 2% параформальдегида (PFA), подготовленный в PBS и хранится в течение ночи при температуре 4 ° C .
Представитель Результаты:
После спиннинг градиенты, 70% -30% интерфазе должно иметь определенную белый ореол, и количественного определения клетки оправился от наивного мыши должны дать 3-5 x10 5 клеток на мышь (плюс мозг спинной мозг). Воспаление мозга, возможно, начиная количества воспалительных клеток в зависимости от ЦНС оскорбление или модели заболевания (рис. 1).
Рисунок 1. Выделение мононуклеарных клеток, от наивных и EAE мозга на пике болезни. Клетки мозга суспензий были разделены на разрывной 70% / 30% градиенты Перколла. Клетки окрашивали инкубировали с Fc-блок следуют анти-CD45 антител в течение 30 мин на льду. Клетки промывали в ячейке буфера окрашивания, и фиксируется в 2% PFA до приобретения в ЛСР-II. CD45 интенсивность измеряется в Y-оси, где три отдельные популяции визуализируются. Дальнейшая характеристика иммунной фенотип CD45 привет проникают клетки осуществляется с помощью дополнительных антител, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ поверхности клеток маркеры в ЦНС лейкоцитов из нормальных и воспаленных тканях мышей был использован в течение нескольких десятилетий 1-3. Изоляция протоколы основаны на разделении микроглии и лейкоцитов по плотности 4 центрифугирования. Здесь мы опишем быстрый и эффективный метод выделения ЦНС лейкоцитов использовании разрывных градиенты Перколла. После выделения клеток при окраске различные антитела, такие как, но не ограничиваясь-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19 и т.д. позволяет идентифицировать иммунной населения, которые проникают в ЦНС при индукции конкретной патологии. Окрашивание с анти-CD45 антител показывает три различных популяций с помощью проточной цитометрии; (1) CD45 отрицательные популяция, состоящая из нервных клеток, астроцитов и олигодендроцитов между клетками других нервов, (2) CD45 вот или промежуточных который содержит в основном surveillant клеток микроглии, (3) CD45 привет популяция, состоящая из проникают гематогенным лейкоцитов. Изучение вклада миелоидных клеток при патологии ЦНС была сложной. Тем не менее, сочетание различных поверхностных клеток маркеры 5, 6 и использования костного мозга химерных мышах показали, понимание функциональных различий миелоидных клеток при воспалении ЦНС 2, 7, 8. После иммунизации с пептидами миелина, аутоиммунные реакции индуцированного и массовый приток клеток крови набирается в мозг. После этого момента, есть широкий репертуар антител доступны для изучения фенотипа этих клеток либо присутствие различных молекул клеточной поверхности, а также выражение внутриклеточных белков, таких как цитокины или факторы транскрипции.
При гомогенизации тканей, будьте предельно осторожны обработки гомогенизатор с легкостью. Мононуклеарных фагоцитов очень восприимчивы к автолиза. Если испытываете слипания клеток, практика мягкий гомогенизации протокол и добавить ДНКазы в буфер во время гомогенизации шаг. Таким образом, оценить процент клеточных мертвым в своей изолированной популяции. Этот протокол может быть легко изменен, чтобы добавить различные ферменты, такие как коллагеназа, dispase среди других. Выход клеток, как правило, выше. Однако некоторые маркеры клеточной поверхности, подвержены такого лечения и, следовательно, будет ограничивать их обнаружение с помощью проточной цитометрии в связи с их расщепления протеазами. В нашем протокол, мы обычно избегать использования ферментов, рассекать ткани как можно быстрее без ущерба для перфузии, а не оставлять тканях в течение длительного периода времени на льду (> 1 час) до гомогенизации. Протокол, описанный имеет потенциал, чтобы быть применены к экспрессии генов, белков и клеточных культур из изолированной популяции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального общества рассеянного склероза (TA 3021-A1 / T для AEC) и Техасского университета в Сан-Антонио.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
|
References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
