Summary
המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מהיר יעיל לבודד תאים mononuclear מרקמות המוח ואת חוט השדרה אשר יכול להיות מנוצל ביעילות עבור ניתוחים תזרים cytometric.
Abstract
בידוד של תאים חיסוניים כי לחדור למערכת העצבים המרכזית (CNS) במהלך, אוטואימוניות זיהום, טראומה או ניוון מוחיים, נדרש לעתים קרובות להגדיר את הפנוטיפ שלהם פונקציות מפעיל. גישות Histochemical הם סייעה לקבוע את המיקום של התאים שחדרו ולנתח את מערכת העצבים המרכזית קשורה לפתולוגיה. עם זאת, ב-situ histochemistry וטכניקות צביעה immunofluorescent מוגבלים במספר נוגדנים, שניתן להשתמש בהם בכל פעם בודד כדי לאפיין תת תא החיסון ברקמה מסוימת. לכן, גישות היסטולוגית יחד עם החיסון phenotyping ידי cytometry זרימה הם קריטיים לחלוטין לאפיין את ההרכב של חדירה למערכת העצבים המרכזית המקומית. פרוטוקול זה מבוסס על הפרדה של מערכת העצבים המרכזית השעיות הסלולר על discontinous percoll הדרגתיים. המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מהיר יעיל לבודד תאים mononuclear מרקמות המוח ואת חוט השדרה אשר יכול להיות מנוצל באופן יעיל לזיהוי אוכלוסיות תאים שונות של החיסון יחיד מדגם ידי cytometry הזרימה.
Protocol
הכנה של ריאגנטים
הכינו מלאי איזוטוני percoll (SIP), 4 מ"ל לכל המוח, על ידי ערבוב 9 חלקים percoll עם חלק אחד של 10X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +.
הכן SIP ב 70% 1X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +, 2 מ"ל לכל המוח לוותר לתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל חרוטי.
הערה: מומלץ percoll יש להשתמש בטמפרטורת החדר, אם משתמשים בו קר, תאים נוטים גוש והפרדה התא הוא פחות יעיל.
רקמות איסוף homogenization
הרדימי עכברים perfuse דרך החדר השמאלי עם קרים כקרח HBSS 1X. לנתח את המוח ואת חוט השדרה ולשמור על RPMI ללא פנול אדום עד שכל העכברים מוקרבים.
רקמות מקום 7 או 15 מ"ל dounce homogenizer המכיל 3 מ"ל של RPMI, בעדינות לעשות השעיה תא עם העלי רפויים (גודל) ואחריו העלי Tigh צמודה (גודל ב ') כדי להמשיך לנתק את הרקמות. השלם את נפח של המתלים התא מ"ל 7 עם RPMI.
צבע להגדיר
הוסף 3 מ"ל של SIP כדי השעיית התא לבצע SIP 30% הסופי
לאט לאט שכבת ההשעיה תא 10 מ"ל על גבי SIP 70%. זהו השלב הקריטי ביותר של ההליך, השתמש פיפטה, סיוע להגדיר במצב כבידה למנוע ערבוב של 70% ו 30% פתרונות. קו שטוח מאוד ברור צריך להיות גלוי בצומת 70% -30%.
צנטריפוגה 30 דקות ב 500 גרם 18 ° C. ודא צנטריפוגות יפסיקו עם בלם מינימלית או לא, כך שלבי הביניים אינה מופרעת.
שימוש pipet העברה, בעדינות להסיר את השכבה של פסולת מהחלק העליון של הצינור ולאסוף 2.0-3.0 מ"ל של שלבי הביניים 70% -30% לתוך צינור חרוטי נקי המכיל 8 מ"ל של 1X HBSS. ודא percoll המכיל את שלבי הביניים הוא מדולל על פי שלוש, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך centrifugre ו 7 דקות ב 500 גרם ב 18 ° C.
Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של חיץ מכתים תא ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל לשטוף עוד פעם אחת באמצעות צנטריפוגות מיקרו ב 10,000 G 1 דקות ב 4 ° C.
נוגדן מכתים
כדורי Resuspend ב 50 μl של מטוהרים antimouse CD16/CD32 מדולל 1:200 במאגר מכתים התא כדי לחסום את אתרי הקישור Fc. לדגור על קרח למשך 10 דקות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
הוסף 50 μl של שילוב נוגדן קוקטייל לדגור על קרח למשך 30 דקות. נוגדן כל חייב להיות טיטרציה הראשון להעריך דילול אופטימלי. השתמש שילובים fluorochrome המתאים נבחר על פי היכולות של לייזר הגדרות המסנן של cytometer תזרים הספציפית שלך.
שטפו תאים חיץ תא מכתים, כדורי resuspend ב μl 100-200 של חיץ מכתים תא ולנתח מיד cytometer, או לחילופין תאים ניתן resuspended paraformaldehyde ב 2% (PFA) שהוכנו PBS ומאוחסנים יתר בלילה 4 ° C .
נציג תוצאות:
אחרי סיבוב הדרגתיים, את שלבי הביניים 70% -30% צריך הילה לבנה מוגדר, quantitation של תאים התאושש עכבר תמים צריך להניב 3-5 x10 5 תאים לכל עכבר (המוח וחוט השדרה ועוד). דלקת המוח אולי החל מספרים של תאים דלקתיים בהתאם העלבון CNS או מודל המחלה (איור 1).
באיור 1. בידוד של תאים mononuclear, מן תמים EAE מוח על המחלה שיא. תאים השעיות המוח הופרדו על רציפות 70% / 30% percoll הדרגתיים. מוכתם תאים הודגרו עם FC-לחסום ואחריו אנטי CD45 נוגדנים למשך 30 דקות על הקרח. תאים שהיו שטופים במאגר מכתים התא קבוע ברכישת PFA 2% מוקדם LSR-II. CD45 העוצמה נמדדת על ציר Y, כאשר שלוש האוכלוסיות ברורים הם דמיינו. אפיון נוסף של פנוטיפ החיסונית של CD45 בתאי היי חדירה מיושמת באמצעות נוגדנים נוספים ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח של השטח סמנים תא leukocytes CNS מרקמות עכבר רגיל מודלק נוצל במשך כמה עשורים 1-3. פרוטוקולים בידוד מבוססים הפרדת microglia ו leukocytes ידי 4 צנטריפוגה צפיפות. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה של בידוד CNS leukocytes באמצעות רציפה הדרגתיים percoll. אחרי בידוד של תאים, צביעה עם נוגדנים שונים כגון, אך לא מוגבל-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19, וכו 'מאפשר זיהוי של אוכלוסיות החיסונית לחדור למערכת העצבים המרכזית על אינדוקציה של פתולוגיה מסוימת. מכתים עם אנטי CD45 נוגדנים מגלה שלוש האוכלוסיות שונות על ידי זרימת cytometry: (1) CD45 אוכלוסיה שלילי בהיקף של תאים, האסטרוציטים עצב oligodendrocytes בין תאים אחרים העצבים, (2) CD45 lo או ביניים אשר מכיל תאים microglial surveillant בעיקר, (3) CD45 האוכלוסייה היי המורכב חדירה leukocytes hematogenous. הלומד את תרומתה של תאים מיאלואידית במהלך פתולוגיות CNS כבר מאתגר. עם זאת, השילוב של סמנים תאים שונים פני 5, 6 ו את השימוש של עכברים מח עצם chimeric הראו תובנות ההבחנות תפקודית של תאים מיאלואידית במהלך דלקת במערכת העצבים המרכזית 2, 7, 8. לאחר חיסון עם פפטידים המיאלין, תגובה אוטואימונית הוא המושרה ואת זרם מסיבי של כדוריות דם הוא גייס למוח. לאחר שלב זה, יש רפרטואר רחב של נוגדנים זמין ללמוד את הפנוטיפ של תאים אלה גם על ידי נוכחות של מולקולות פני השטח שונים בתא, כמו גם ביטוי של חלבונים תאיים כגון ציטוקינים או גורמי שעתוק.
כאשר שמאחד את הרקמות, לנקוט זהירות רבה בטיפול homogenizer בקלות. Phagocytes mononuclear רגישים מאוד autolysis. אם חווה clumping של התאים, בפועל פרוטוקול homogenization עדין ולהוסיף DNase למאגר במהלך השלב homogenization. לכן, להעריך אחוז תאים מתים באוכלוסייה מבודדת שלך. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות להוסיף אנזימי עיכול שונות, כגון collagenase, dispase בין היתר. התשואה של תאים הוא בדרך כלל גבוה יותר. עם זאת חלק משטח התא סמנים רגישים טיפול זה ולכן יהיה גבול הגילוי שלהם על ידי זרימת cytometry עקב מחשוף שלהם על ידי פרוטאזות. בפרוטוקול שלנו, אנו שגרתי למנוע את השימוש של אנזימי עיכול, לנתח הרקמות מהר ככל האפשר מבלי להתפשר על זלוף, ולהימנע מלהשאיר את הרקמות עבור תקופות זמן ארוכות על הקרח (> 1 שעות) homogenization מוקדמת. פרוטוקול תיאר יש לו את הפוטנציאל להיות מיושם תרבות גן, ביטוי חלבון תא האוכלוסייה מבודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי טרשת נפוצה האגודה הלאומית (ת"א 3021-A1 / T ל AEC) של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
|
References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
