Summary
O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para análises de citometria de fluxo.
Abstract
Isolamento de células do sistema imunológico que se infiltrar no sistema nervoso central (SNC) durante a infecção, trauma auto-imunidade, ou neurodegeneração, é muitas vezes necessária para definir seu fenótipo e funções efetoras. Abordagens histoquímica são instrumentais para determinar a localização das células infiltrando e analisar o SNC patologia associada. No entanto, in-situ histoquímica e técnicas de coloração de imunofluorescência são limitados pelo número de anticorpos que podem ser usados em uma única vez para caracterizar os subtipos de células imunes em um tecido particular. Portanto, as abordagens histológicas em conjunto com imuno-fenotipagem por citometria de fluxo são fundamentais para caracterizar completamente a composição do CNS infiltração local. Este protocolo é baseado na separação do CNS suspensões celulares mais descontínua Percoll gradientes. O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para a identificação de várias populações de células imunes em uma única amostra por citometria de fluxo.
Protocol
Preparação de reagentes
Prepare estoque isotônica Percoll (SIP), 4 ml por cérebro, através da mistura de 9 partes de Percoll com uma parte de HBSS 10X sem Ca + + e Mg + +.
Prepare SIP menos 70% em 1X HBSS sem Ca + + e Mg + +, 2 ml por cérebro dispensado em um tubo de polipropileno 15 ml.
Nota: Recomenda-se que Percoll deve ser usado em temperatura ambiente, se usado frio, as células tendem a aglutinar-se e separação celular é menos eficiente.
Coleta de tecido e homogeneização
Anestesiar ratos e perfundir através do ventrículo esquerdo com gelado HBSS 1X. Dissecar o cérebro ea medula espinhal e manter em RPMI sem vermelho de fenol até que todos os ratos são sacrificados.
Tecidos lugar em 7 ou 15 ml Dounce homogeneizador contendo 3 ml de RPMI, gentilmente fazer uma suspensão de células com um pilão largas (A tamanho), seguido de um pilão Tigh-fitting (tamanho B) para continuar a dissociar os tecidos. Completar o volume de suspensões de células a 7 ml com RPMI.
Gradiente de set up
Adicionar 3 ml de SIP para a suspensão de células para fazer um SIP final de 30%
Lentamente, a camada de suspensão de células 10 mL em cima da SIP 70%. Esta é a etapa mais crítica do procedimento, use uma pipeta ajuda-set no modo de gravidade evitando a mistura de 70% e soluções de 30%. Uma linha muito clara flat deve estar visível na junção 70% -30%.
Centrifugar 30 minutos a 500G 18 ° C. Certifique-se de centrífuga vai parar com o freio de um mínimo ou nenhum de modo que a interfase não é perturbado.
Usando uma pipeta de transferência, remova a camada de detritos a partir do topo do tubo e recolher 2,0-3,0 ml da interfase 70% -30% em um tubo limpo cônico contendo 8 ml de 1X HBSS. Garantir que o Percoll contendo a interfase é diluída cerca de três vezes, misturar algumas vezes por inversão e min centrifugre 7 a 500G a 18 ° C.
Ressuspender sedimento em 1 ml de tampão de coloração celular e transferi-lo para um tubo de 1,5 ml e lavar mais uma vez usando uma centrífuga de micro-a 10.000 G 1 min a 4 ° C.
Coloração de anticorpos
Pellets ressuspender em 50 ul de purificada antimouse CD16/CD32 diluído 1:200 em tampão de coloração celular para bloquear os sites Fc vinculativo. Incubar mais de gelo por 10 min. Contagem de células utilizando um hemocitômetro.
Adicionar 50 ul de mistura de anticorpos cocktail e incubar no gelo por 30 min. Cada anticorpo deve ser o primeiro a avaliar titulada de diluição ideal. Uso adequado combinações fluorocromo escolhidos de acordo com as capacidades do laser e configurações de filtro do seu citômetro de fluxo particular.
Lave as células em tampão de células coloração, pellets ressuspender em 100-200 mL de tampão de coloração de células e analisar imediatamente no citômetro, ou, alternativamente, as células podem ser suspensas em paraformaldeído 2% (PFA), preparado em PBS e armazenado durante a noite a 4 ° C .
Resultados representativos:
Depois de girar os gradientes, a interfase 70% -30% deve ter definido um halo branco, e quantificação das células recuperou de um rato ingênuo deve render 3-5 x10 5 células por mouse (cérebro além da medula espinhal). Cérebro inflamado pode ter números que variam de células inflamatórias, dependendo do insulto SNC ou modelo de doença (Figura 1).
Figura 1. Isolamento de células mononucleares, a partir de ingênuo e EAE-cérebro na doença de pico. Suspensões de células cerebrais foram separados mais de 70% descontínua / gradientes de Percoll 30%. Manchada células foram incubadas com Fc-bloco seguido por anti-CD45 anticorpos por 30 min no gelo. As células foram lavadas em tampão coloração celular e fixa em 2% aquisição PFA antes em um LSR-II. CD45 intensidade é medida no eixo Y, onde três populações distintas são visualizados. Uma melhor caracterização do fenótipo imunológico de células CD45 oi infiltrando é implementado usando anticorpos adicionais e posteriormente analisadas por citometria de fluxo.
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Discussion
Análises de marcadores de superfície celular no SNC leucócitos a partir de tecidos de rato normal e inflamado tem sido utilizado por várias décadas 1-3. Protocolos de isolamento são baseados na separação de microglia e leucócitos por 4 centrifugação densidade. Aqui nós descrevemos um método rápido e eficaz de isolar CNS leucócitos usando gradientes descontínuos de Percoll. Após o isolamento de células, coloração com anticorpos diversos, tais como, mas não se limitando a-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19, etc permite a identificação de populações imunológico que infiltram o SNC sobre a indução de uma patologia particular. Coloração com anticorpos anti-CD45 revela três populações distintas por citometria de fluxo; (1) CD45 negativo da população constituída por células neuronais, astrócitos e oligodendrócitos entre as células nervosas outros, (2) CD45 lo ou intermediário, que contém principalmente surveillant células da microglia, (3) CD45 população oi consistindo de leucócitos infiltrantes hematogênica. Estudar a contribuição das células mielóides durante patologias do SNC tem sido um desafio. No entanto, a combinação de vários marcadores de células superficiais 5, 6 e uso de camundongos quiméricos medula óssea mostraram insights sobre as distinções funcionais de células mielóides durante o CNS inflamação 2, 7, 8. Após a imunização com peptídeos de mielina, uma reação auto-imune é induzido e um afluxo maciço de células do sangue é recrutado para o cérebro. Após este ponto, há um amplo repertório de anticorpos disponíveis para estudar o fenótipo destas células, quer pela presença de moléculas de superfície de células diferentes, bem como a expressão de proteínas intracelulares, tais como citocinas ou fatores de transcrição.
Quando homogeneização dos tecidos, use extrema cautela manusear o homogeneizador com facilidade. Fagócitos mononucleares são altamente suscetíveis a autólise. Se experimentando aglutinação das células, a prática de um protocolo suave homogeneização e adicionar DNase para o buffer durante a etapa de homogeneização. Portanto, avaliar a porcentagem de células mortas na sua população isolada. Este protocolo pode ser facilmente modificado para adicionar várias enzimas digestivas, tais como colagenase, dispase entre outros. O rendimento das células é geralmente mais elevada. No entanto, alguns marcadores de superfície celular são suscetíveis a esse tratamento e, portanto, limitar a sua detecção por citometria de fluxo, devido à sua clivagem por proteases. Em nosso protocolo, que rotineiramente evitar o uso de enzimas digestivas, dissecar tecidos mais rápido possível, sem comprometer a perfusão, e evite deixar os tecidos por longos períodos de tempo no gelo (> 1h) homogeneização prévia. O protocolo descrito tem o potencial de ser aplicado à cultura gene da proteína de expressão e de células da população isolada.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T para AEC) e da Universidade do Texas em San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
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References
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