Summary
L'articolo attuale descrive un protocollo rapido per isolare in modo efficace le cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale che può essere efficacemente utilizzato per le analisi di citometria a flusso.
Abstract
Isolamento di cellule immunitarie che si infiltrano nel sistema nervoso centrale (SNC) durante l'infezione, traumi, malattie autoimmuni o neurodegenerazione, è spesso necessaria per definire la loro fenotipo e funzioni effettrici. Approcci istochimiche sono strumentali per determinare la posizione delle celle di infiltrarsi e di analizzare il sistema nervoso centrale associata patologia. Tuttavia, in situ e tecniche di colorazione istochimica immunofluorescenza sono limitati dal numero di anticorpi che possono essere usati in una sola volta a caratterizzare sottotipi di cellule immunitarie in un particolare tessuto. Pertanto, gli approcci istologici in collaborazione con immuno-fenotipo mediante citometria di flusso sono fondamentali per caratterizzare completamente la composizione del locale infiltrazione sistema nervoso centrale. Questo protocollo si basa sulla separazione del sistema nervoso centrale sospensioni cellulari più discontinue gradienti di Percoll. L'articolo attuale descrive un protocollo rapido per isolare in modo efficace le cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale che può essere efficacemente utilizzato per l'identificazione delle varie popolazioni di cellule immunitarie in un singolo campione mediante citometria di flusso.
Protocol
Preparazione dei reagenti
Preparare magazzino isotonica Percoll (SIP), 4 ml al cervello, mescolando 9 parti di Percoll con una parte di HBSS 10X senza Ca + + e Mg + +.
Preparare SIP al 70% in 1X HBSS senza Ca + + e Mg + +, 2 ml al cervello dispensato in un tubo da 15 ml in polipropilene.
Nota: Si raccomanda di Percoll dovrebbe essere usato a temperatura ambiente, se usato a freddo, le cellule tendono a raggrupparsi e la separazione delle cellule è meno efficiente.
Tessuto di raccolta e omogeneizzazione
Anestetizzare topi e profumato attraverso il ventricolo sinistro con HBSS 1X ghiacciata. Sezionare il cervello e il midollo spinale e mantenere in RPMI senza rosso fenolo fino a quando tutti i topi vengono sacrificati.
Tessuti posto in 7 o 15 ml dounce omogeneizzatore contenente 3 ml di RPMI, gentilmente fare una sospensione cellulare con una linea morbida pestello (Una dimensione) seguito da un Tigh-montaggio pestello (dimensione B) per dissociare ulteriormente i tessuti. Completa il volume della sospensione cellulare a 7 ml con RPMI.
Gradiente impostato
Aggiungere 3 ml di SIP alla sospensione cellulare per fare un SIP finale del 30%
Lentamente lo strato di sospensione cellulare 10 ml sulla parte superiore della SIP 70%. Questa è la fase più critica della procedura, utilizzare una pipetta-aiuto al modo di gravità evitando la miscelazione del 70% e il 30% delle soluzioni. Una linea molto chiara piatto dovrebbe essere visibile al 70% -30% di giunzione.
Centrifugare 30 min a 500G 18 ° C. Assicurarsi centrifuga si ferma con freno minimo o nessun modo che l'interfase non è disturbato.
Utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere delicatamente lo strato di detriti dalla parte superiore del tubo e raccogliere 2,0-3,0 ml di 70% -30% interfase in una provetta pulita conica contenente 8 ml di 1X HBSS. Assicurarsi che il Percoll contenente l'interfase viene diluita a circa tre volte, mescolare un paio di volte per inversione e centrifugre 7 min a 500G a 18 ° C.
Risospendere il pellet in 1 ml di buffer di colorazione della cellula e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml e lavare ancora una volta utilizzando un micro-centrifuga a 10.000 G 1 min a 4 ° C.
Anticorpi colorazione
Pellet Risospendere in 50 ml di purificato antimouse CD16/CD32 diluito 1:200 in tampone di colorazione delle cellule per bloccare i siti di legame Fc. Incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
Aggiungere 50 ml di miscela di anticorpi cocktail e incubare in ghiaccio per 30 min. Ogni anticorpo deve essere il primo titolato a valutare la diluizione ottimale. Uso appropriato combinazioni fluorocromo scelti in base alla capacità di laser e impostazioni del filtro del citofluorimetro particolare.
Lavare le cellule in tampone di colorazione della cellula, pellets risospendere in 100-200 ml di buffer di colorazione della cellula e di analizzare immediatamente nel citometro, o in alternativa le cellule possono essere risospese in 2% paraformaldeide (PFA), preparati in PBS e conservato durante la notte a 4 ° C .
Rappresentante dei risultati:
Dopo avere girato le pendenze, il 70% -30% interfase dovrebbe avere definito un alone bianco, e la quantificazione delle cellule recuperate da un mouse ingenuo deve cedere 3-5 x10 5 celle per il mouse (cervello più midollo spinale). Cervello infiammato potrebbe avere i numeri che variano a seconda delle cellule infiammatorie del sistema nervoso centrale insulto o modello di malattia (Figura 1).
Figura 1. Isolamento di cellule mononucleate, da ingenuo e EAE-cervello a malattia di picco. Le cellule cerebrali sono stati separati sospensioni più discontinuo del 70% / pendenze Percoll 30%. Macchiato le cellule sono state incubate con Fc-block seguiti da anticorpi anti-CD45 per 30 minuti sul ghiaccio. Le cellule sono state lavate in tampone di colorazione della cellula, e fissato nel 2% PFA prima acquisizione in un LSR-II. CD45 intensità è misurata in asse Y, dove tre popolazioni distinte sono visualizzati. Un'ulteriore caratterizzazione del fenotipo CD45 delle cellule immunitarie di alta infiltrazione è implementata utilizzando anticorpi aggiuntivi e successivamente analizzati mediante citometria di flusso.
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Discussion
Le analisi di marcatori cellulari di superficie nei leucociti sistema nervoso centrale dai tessuti del mouse normale e infiammata è stata utilizzata per decenni 1-3. Protocolli di isolamento si basano nella separazione della microglia e leucociti da 4 densità centrifugazione. Qui si descrive un metodo veloce ed efficace di isolare leucociti sistema nervoso centrale mediante gradienti di Percoll discontinuo. Dopo l'isolamento delle cellule, colorazione con anticorpi diversi come ad esempio-ma non limitato a-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19, ecc permette l'identificazione delle popolazioni immunitario che infiltrano il SNC su induzione di una particolare patologia. Colorazione con anticorpi anti-CD45 rivela tre popolazioni distinte mediante citometria di flusso (1); popolazione CD45 negativo costituito da cellule neuronali, astrociti e oligodendrociti tra le cellule nervose gli altri, (2) lo CD45 o intermedia che contiene la maggior parte delle cellule microgliali Surveillant, (3) CD45 popolazione hi composto da infiltrazione dei leucociti ematogena. Studiando il contributo delle cellule mieloidi durante patologie sistema nervoso centrale è stato impegnativo. Tuttavia, la combinazione di diversi marcatori di superficie delle cellule 5, 6 e l'uso del midollo osseo di topi chimerici hanno dimostrato intuizioni sulla distinzione funzionale delle cellule mieloidi durante l'infiammazione del SNC 2, 7, 8. Su vaccinazione con peptidi mielina, una reazione autoimmune è indotta e un massiccio afflusso di cellule del sangue è reclutato al cervello. Dopo questo punto, vi è un ampio repertorio di anticorpi a disposizione per studiare il fenotipo di queste cellule sia dalla presenza di varie molecole della superficie cellulare, così come l'espressione di proteine intracellulari come le citochine o fattori di trascrizione.
Quando omogeneizzazione dei tessuti, utilizzare estrema cautela la manipolazione del omogeneizzatore con facilità. Fagociti mononucleari sono altamente suscettibili di autolisi. Se sperimentando aggregazione delle cellule, la pratica un protocollo di omogeneizzazione dolce e aggiungere DNase al buffer durante la fase di omogeneizzazione. Pertanto, valutare la percentuale di cellule morte nella vostra popolazione isolata. Questo protocollo può essere facilmente modificato per aggiungere vari enzimi digerire, come la collagenasi, dispasi tra gli altri. Il rendimento delle celle è di solito più alto. Tuttavia alcuni marcatori cellulari di superficie sono sensibili a questo trattamento e quindi limiterà la loro individuazione mediante citometria di flusso a causa della loro scissione da proteasi. Nel nostro protocollo, abbiamo regolarmente evitare l'uso di enzimi digerire, sezionare i tessuti più velocemente possibile senza compromettere la perfusione, ed evitare di lasciare i tessuti per lunghi periodi di tempo sul ghiaccio (> 1 ora) omogeneizzazione prima. Il protocollo descritto ha il potenziale per essere applicato a gene espressione della cultura, delle proteine e delle cellule della popolazione isolata.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società Nazionale Sclerosi Multipla (TA 3021-A1 / T per AEC) e l'Università del Texas a San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
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References
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