Summary
현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
감염, 외상, autoimmunity 또는 neurodegeneration 동안 중추 신경계 (CNS)를 침투 면역 세포의 분리는 종종 자신의 표현형 및 이펙터 기능을 정의해야합니다. Histochemical 접근 침투 세포의 위치를 파악하고 병리 관련 CNS를 분석하는 수단입니다. 그러나, 원위치 histochemistry과 immunofluorescent 얼룩 기술은 특정 조직에 면역 세포 subtypes을 특성화하기 위해 한 번에 사용할 수있는 항체의 숫자에 의해 제한됩니다. 따라서, 유동세포계측법에 의해 면역 - phenotyping와 함께 histological 접근 방법이 완전히 지역 CNS의 침투의 조성을 특성화하기 위해 중요하다. 이 프로토콜은 discontinous percoll 그라디언트를 통해 CNS 세포 suspensions의 분리에 따라 달라집니다. 현재 문서는 효율적으로 효과적으로 유동세포계측법하여 하나의 샘플에서 다양한 면역 세포 집단의 식별을 위해 활용할 수있는 두뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
시약의 준비
칼슘없이 10X HBSS의 한 부분과 percoll 9 부분을 혼합하여 주식 isotonic percoll (SIP), 뇌 당 4 ML을 준비 + +와 MG + +.
없이 1X HBSS 70 %로 SIP를 준비 칼슘 + +와 MG + +, 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 적절 뇌의 당 2 ML.
참고 :이 percoll은 실온에서 사용해야하는 것이 좋습니다, 감기를 사용한 경우, 세포 클럼프하는 경향과 세포 분리 덜 효율적이다.
조직 수집 및 균질화
얼음처럼 차가운 1X HBSS과 좌심실을 통해 마우스 및 perfuse를 마취. 뇌 및 척수를 해부하다 모든 생쥐가 희생되기 전까지는 페놀 레드없는 RPMI으로 유지합니다.
7 15 ML 다운스 호모 지 나이저는 RPMI 3 ML을 포함에서 개최 조직은 부드럽게 추가로 조직을 떼어 놓다하는 타이 맞는 유봉 (B 크기) 다음 느슨한 맞는 유봉 (크기)와 세포 현탁액합니다. RPMI 7 개의 ML에 셀 suspensions의 볼륨을 작성합니다.
그라데이션이 설정
최종 30 % SIP를 만들기 위해 세포 현탁액에 SIP 3 ML 추가
천천히 계층 70 % SIP 위에 10 ML 세포 현탁액. 이 절차의 가장 중요한 단계이며, 70 % 혼합하여 30 % 솔루션을 피하고 중력 모드에서 설정 피펫 에이드를 사용합니다. 명확 평평한 라인은 70 % -30 %의 교차점에 표시되어야합니다.
500G 18 ° C.에서 30 분 원심 분리기 원심 분리기는 계면이 방해되지 않도록 최소한의 또는 전혀 브레이크와 함께 중지됩니다 있는지 확인하십시오.
전송 pipet을 사용하면 부드럽게 튜브의 상단에서 파편의 레이어를 제거하고 1X HBSS 8 ML을 포함한 깨끗한 원뿔 관에 70 % -30 %의 계면의 2.0-3.0 ML를 수집합니다. 계면을 포함하고있는 percoll 세 배에 대한 희석되었는지 확인, 18 500G에서 역전과 centrifugre 7 분으로 몇 번 혼합 ° C.
Resuspend 세포 얼룩 버퍼 1 ML의 펠렛 및 1.5 ML 튜브로 전송하고 4 만 G 1 분 ° C.에서 마이크로 원심 분리기를 사용하여 한 번 더 씻어
항체 염색법
antimouse CD16/CD32 투석을 50 μl의 Resuspend 알약은 FC 바인딩 사이트를 차단하는 세포 얼룩 버퍼에 1:200 희석. 10 분 얼음 위에 알을 품다. hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다.
30 분 얼음 항체 칵테일 믹스와 부화 50 μl를 추가합니다. 각 항체 먼저 최적의 희석을 평가하기 위해 titrated해야합니다. 레이저와 특정 흐름 cytometer의 필터 설정의 기능에 따라 선택한 해당 fluorochrome 조합을 사용합니다.
세포 얼룩 버퍼의 100-200 μl의 세포 얼룩 버퍼, resuspend 알약의 세포를 세척하고 cytometer에 즉시 분석하거나, 또는 세포는 4 PBS의 준비 2 % paraformaldehyde (PFA)에 resuspended 이상 박 저장할 수 있습니다 ° C .
대표 결과 :
그라디언트를 회전 후, 70 % -30 %의 계면은 정의된 흰색 후광이 있어야하고, 순진한 마우스에서 발견한 세포의 quantitation 마우스 당 3-5 X10 5 세포 (뇌 척수 플러스) 양보해야합니다. 염증 두뇌 CNS의 모욕 또는 질병 모델 (그림 1)에 따라 염증 세포의 숫자까지 할 수도 있습니다.
그림 1. 피크 질병에 순진하고 EAE - 머리에서 mononuclear 세포의 분리. 뇌 세포의 suspensions는 불연속 70% / 30 % percoll의 그라디언트를 통해 분리되었다. 세포 얼룩이 얼음에 30 분 안티 CD45 항체 뒤에 FC - 블록 incubated되었습니다. 세포는 세포 얼룩 버퍼에 씻어서하고, LSR - II에 2% PFA 전에 인수에서 수정되었습니다. CD45 강도는 세 개의 서로 다른 인구가 시각의 Y - 축 단위로 측정됩니다. CD45 안녕 침투 세포의 면역 표현형의 추가 특성이 추가 항체를 사용하여 구현하고 이후 유동세포계측법 의해 분석됩니다.
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Discussion
정상 및 염증 마우스 조직에서 CNS의 leukocytes의 세포 표면 마커의 분석은 1-3 몇 수십 년 동안 이용되었다. 격리 프로토콜은 밀도 원심 분리에 의해 4 microglia 및 leukocytes의 분리에 근거하고 있습니다. 여기 불연속 percoll의 그라디언트를 사용하여 CNS의 leukocytes를 격리의 신속하고 효과적인 방법을 설명합니다. 세포의 분리 후, 각종 항체와 얼룩으로 - 이에 - CD45 이에 국한되지 않음, CD4, CD8, CD11b, CD19, 등 특정 병리의 유도에 따라 CNS에 침투해 면역 인구의 식별을 허용합니다. 안티 CD45 항체와 얼룩 것은 유동세포계측법하여 세 개의 서로 다른 인구를 보여, (1)의 연결을 세포, astrocytes와 다른 신경 세포 사이에 oligodendrocytes, 구성 CD45 부정적인 인구 (2) 대부분 surveillant microglial 세포 (3)를 포함 CD45 싸다, 또는 중간 CD45 히 인구 hematogenous leukocytes을 침투 구성. CNS의 pathologies 동안 골수양 세포의 기여를 공부하는 것은 도전했습니다. 그러나, 다양한 세포 표면 마커 5, 6 및 골수 키메라 생쥐의 사용의 조합은 CNS의 염증 2, 7, 8 중 골수양 세포의 기능 특성에 대한 통찰력을 보여주었다. myelin의 펩티드와 함께 예방 접종시, 면역 반응이 유도되고 혈액 세포의 대규모 유입이 뇌에 모집합니다. 이 시점 이후, 중 다양한 세포 표면 분자의 존재에 의해 이러한 세포의 표현형,뿐만 아니라 크린 시토킨 또는 전사 요소로 세포내 단백질의 표현을 연구에 사용할 항체의 다양한 레퍼토리가 있습니다.
조직을 homogenizing 때, 쉽게 균질 화기를 취급 극단주의를 사용합니다. Mononuclear phagocytes는 autolysis에 매우 취약합니다. 세포의 clumping 발생한 경우, gentler 균질 프로토콜을 연습하고 균질 단계 동안 버퍼에 DNase를 추가합니다. 따라서 귀하의 고립 인구의 죽은 세포의 비율을 평가합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다른 사람들과 같은 collagenase, dispase 등 다양한 소화 효소를 추가로 수정할 수 있습니다. 세포의 수확량은 일반적으로 높다. 그러나 일부 세포 표면 표식이 치료에 민감한 때문에 프로 테아제에 의해 자신의 절단으로 인해 유동세포계측법하여 검색을 제한합니다. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 정기적으로 소화 효소의 사용을 피하기, 재관류을 손상시키지 않고 가능한 한 빠른 조직을 절개하다, 얼음 (> 1 시간) 이전에 균질에서 오랜 기간 동안 조직을 떠나는하지 마십시오. 설명 프로토콜은 고립된 인구의 유전자 표현, 단백질 및 세포 문화에 적용할 수있는 가능성이있다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 다중 경화증 협회 (TA AEC에 3021 - A1 / T)와 산 안토니오 텍사스 대학에 의해 지원되었다.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
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References
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