Summary
現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリー分析に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を分離するために迅速なプロトコルを記述します。
Abstract
感染症、外傷、自己免疫疾患または神経変性における中枢神経系（CNS）に浸潤する免疫細胞の単離は、しばしばそれらの表現型とエフェクター機能を定義する必要があります。組織化学的アプローチは、浸潤細胞の位置を決定するために、病理関連したCNSを分析するための手段です。しかし、現場組織化学および免疫蛍光染色の技法は、特定の組織に免疫細胞のサブタイプを特徴付けるために一度に使用できる抗体の数によって制限されています。したがって、フローサイトメトリーによる免疫フェノタイピングと一緒に組織学的なアプローチは、完全にローカルのCNS浸潤の組成を特徴づけるために不可欠です。このプロトコルは、不連続パーコール勾配以上のCNSの細胞懸濁液の分離に基づいています。現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリーにより、単一のサンプル中の様々な免疫細胞集団の同定に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を単離するために迅速なプロトコルを記述します。
Protocol
試薬の調製
CAがない場合10X HBSSの一部でパーコールの9部を混合することにより、株式等張パーコール（SIP）、脳あたり4 mlを、準備+ +およびMg + +。
15 mlのポリプロピレンコニカルチューブに分注し、脳当たりのCa + +およびMg + +、2 mlのなく1X HBSSで70％でSIPを準備します。
注：これは、パーコールは室温で使用されることをお勧めします、風邪を使用する場合、細胞が塊に傾向があると細胞分離が少なく効率的です。
組織の収集と均質化
氷冷した1 × HBSSで左心室経由でマウスと浸み込ませるの麻酔。脳と脊髄を摘出し、すべてのマウスを屠殺されるまで、フェノールレッドを含まないRPMIで維持する。
RPMI 3mlを含む7または15ミリリットルダウンスホモジナイザーの場所の組織は、優しく、さらに組織を解離するために締め付けフィッティング乳棒（Bサイズ）に続く、緩い乳棒（サイズ）で細胞懸濁液を作る。 RPMIで7 mlに細胞懸濁液の体積を完了します。
勾配は、セットアップ
最終的に30％のSIPを作るために細胞懸濁液に、SIPの3 mlを加え
徐々に層の70％SIPの上に10 mLの細胞懸濁液。これはプロシージャの中で最も重要なステップであり、70％、30％溶液の混合回避重力モードで設定されたピペットエイドを使用してください。非常に明確なフラットラインは70％-30％の接合部で表示する必要があります。
500G 18℃で30分間遠心操作する相間が乱されないように遠心分離機が最小限、あるいはまったくブレーキで停止することを確認してください。
転送ピペットを用いて、軽くチューブの上部からごみの層を除去し、1X HBSS 8mlを含むきれいなコニカルチューブに70％-30％の相間の2.0〜3.0ミリリットルを収集する。相間を含むパーコールは、3倍程度希釈されていることを確認し、18で500Gで反転しcentrifugre 7分で数回混ぜる℃に
懸濁します細胞染色緩衝液1mlでペレットとは、1.5 mlチューブに移すと4℃で10,000 G 1分間℃でマイクロ遠心機を使用して、1つより多くの時間を洗う
抗体染色
ヤギCD16/CD32を精製した50μlに再懸濁し、ペレットは、Fc結合部位をブロックするために細胞の染色バッファーで1:200に希釈した。 10分間氷の上にインキュベートする。血球計算板を用いて細胞を数える。
氷上で30分間抗体のカクテルミックスとインキュベート（50μl）を加えます。各抗体は、最初に最適な希釈を評価するために滴定する必要があります。レーザーと、特定のフローサイトメーターのフィルタ設定の機能に従って、選択した適切な蛍光色素の組み合わせを使用してください。
細胞の染色バッファ100〜200μlの細胞の染色バッファー、再懸濁し、ペレットに細胞を洗浄し、血球計算器で直ちに分析し、あるいは細胞は4℃のPBSで調製した2％パラホルムアルデヒド（PFA）に再懸濁し、一晩保存することができます° C 。
代表的な結果：
グラデーションを回転した後、70％-30％の相間には定義されている白いハロを持っているはず、と素朴なマウスから回収された細胞の定量は、マウスにつき3〜5 × 10 5細胞（脳プラス脊髄）でなければなりません。炎症を起こした脳は中枢神経系の侮辱や疾患モデル（図1）によって炎症細胞数の範囲かもしれない。
図1ピーク疾患におけるナイーブおよびEAE -脳から単核細胞の単離。脳細胞の懸濁液は、不連続70％/ 30％パーコール勾配を介して分離した。染色した細胞を氷上で30分間抗CD45抗体が続くのFc -ブロックとインキュベートした。細胞は、細胞の染色バッファーでリンスし、そしてLSR - IIの2％PFA買収前に修正されました。 CD45の強度は、3つの異なった集団が可視化するY軸、に測定されます。 CD45 ハイテク浸潤細胞の免疫表現型のさらなる特徴は、追加の抗体を使用して実装し、続いてフローサイトメトリーによって分析されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
正常および炎症のマウス組織から中枢神経系の白血球の細胞表面マーカーの分析は、1月3日数十年にわたって利用されている。分離プロトコルは密度遠心4によるミクログリアと白血球の分離に基づいています。ここでは、不連続パーコール勾配を用いて、CNSの白血球を分離するの迅速かつ効果的な方法を説明します。細胞の単離の後、次のような - ではなく、CD45に限られた種々の抗体で染色、CD4、CD8、CD11b、CD19、など特定の病理学の誘導時にCNSに浸潤する免疫個体群の同定が可能になります。他の神経細胞間の神経細胞、アストロサイトやオリゴデンドロサイトで構成される（1）CD45陰性人口、（2）CD45 LOまたは中間（3）、主に監視者ミクログリア細胞を含む、抗CD45抗体で染色すると、フローサイトメトリーによるつの異なる集団を明らかに血行性白血球の浸潤から成るCD45 ハイテクの人口。中枢神経系の病理の間に骨髄細胞の寄与を研究することに挑戦されています。しかし、様々な細胞表面マーカー5、6、骨髄キメラマウスの使い方の組み合わせは、CNSの炎症2、7、8時の骨髄系細胞の機能的な違いへの洞察を示している。ミエリンペプチドで免疫する際に、自己免疫反応が誘導されると血液細胞の大量流入は、脳に募集しております。このポイントの後、様々な細胞表面分子の存在だけでなく、そのようなサイトカインや転写因子などの細胞内タンパク質の発現のいずれかによってこれらの細胞の表現型を研究するために使用できる抗体の幅広いレパートリーがあります。
組織を均質化するときに、簡単にホモジナイザーを取り扱う細心の注意を払ってください。単核食細胞は自己消化に晒されています。細胞の凝集が発生した場合、穏やかな均質化のプロトコルを練習し、均質化工程中にバッファーにDNaseを加える。したがって、孤立した個体群では死細胞の割合を評価する。このプロトコルは、簡単に他の人の間でそのようなコラゲナーゼ、ディスパーゼなどの様々な消化酵素を、追加するように変更することができます。細胞の収率は通常より高いです。しかし、いくつかの細胞表面マーカーは、この治療に感受性であるため、プロテアーゼによるそれらの開裂に起因するフローサイトメトリーにより、その検出が制限されます。我々のプロトコルでは、我々が日常的に消化酵素の使用を避けるため、血流を損なうことなく、可能な限り迅速に組織を解剖し、氷（> 1時間）より前の均質化に長時間の組織を放置したりしないでください。記述されているプロトコルは、孤立した個体群の遺伝子発現、タンパク質や細胞培養に適用される可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、全国多発性硬化症協会（TA AECへの3021 - A1 / T）とテキサス大学サンアントニオ校によってサポートされていました。
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
|
References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
