配对补丁钳从电机神经元和斑马鱼的目标骨骼肌

Summary

幼虫斑马鱼第一脊椎动物的模型系统，让从脊髓运动神经元和目标骨骼肌同时膜片钳记录。本视频演示了用于识别段第电机神经元和目标肌肉细胞以及从不同的细胞类型的录音方法的微观方法。

Abstract

幼虫斑马鱼第一脊椎动物的模型系统，以便从脊髓运动神经元和目标肌肉同时膜片钳记录。这是两种类型的细胞和能力，从视觉上分辨单节段第电机神经元的形态和位置的基础上无障碍的直接后果。本视频演示了用于识别一个CAP电机的神经元和目标肌肉细胞，以及从不同的细胞类型的录音方法的微观方法。第电机神经元类型的鉴定也证实了两种染料充填的生物物理特性，如动作电位的波形和细胞输入电阻。电机神经元录音例行的最后一小时，允许从多个不同的目标肌肉细胞长期的录音。在电机神经元发射模式的控制使神经肌肉接头处突触传递的频率依赖的测量。由于一个大型的量子尺寸和低噪音，全细胞电压钳提供，可以解决所有的单一事件的肌肉。此功能允许的释放特性，囊泡循环，以及突触抑郁症和便利，如基本突触性能的研究。 提供体内准备日食的神经肌肉模型系统的优势，研究了其中电机神经元通常是由外电极刺激的肌肉全细胞膜片钳过大。斑马鱼的准备工作是经得起一个范围广泛，包括转基因株系，吗啉击倒，药物干预，并在体内成像的方法相结合的电生理分析。这些方法，加上越来越多的神经肌肉疾病模型提供的斑马鱼突变体，打开门，为人类的神经肌肉疾病的新理解。

Protocol

1。配对录音鱼的制备

1. 程序开始之前，准备好五个关键的解决方案，其中包括：沐浴液，浴Tricaine（MS222），浴甲酰胺，神经元的内部解决方案和肌肉内部解决方案的解决方案解决方案。
2. 接下来，收集一个单一的幼虫斑马鱼，年龄72至96小时岁之间，在巴斯与Tricaine解决方案的地方。鱼在一分钟暴露的麻醉，不会响应触摸。
3. 放置一个塑料盘上的鱼，使用立体显微镜，具有双重的边缘刀片杀头。
4. 鱼转移到玻璃录音室，涂sylgard和充满槽液。法尔胜在每年年底通过脊索插入电解削尖的钨引脚。
5. 创建一个附近的鱼用别针将提供足够的抓地力了一双细镊子的喙皮瓣。抓住附近的喙针，一双细镊子取出覆皮肤。剥离尾方向慢慢消除皮肤。
6. 治疗浴3-5分钟，以块肌肉的收缩可能会干扰与录音甲酰胺溶液3毫升鱼。洗涤液与正常的5倍。取出轻轻取消钨针的一侧的浅层肌肉的5至6段的一部分。
7. 的鱼转移到一个堂堂正正的显微镜，在位于一个法拉第笼屏蔽电气噪声。显微镜配备有一个固定的阶段，工作距离长40倍的目标和0.5变焦4倍。该显微镜安装在机动XY翻译阶段，以编制高功率下的神经和肌肉之间的移动。利用微分干涉对比光学可视化的神经元。
8. 根据0.5倍变焦，使用一个大口径15微米吸管删除覆的肌肉和揭露脊髓。通过3毫升的一次性注射器和肌肉细胞被删除逐个应用负压。重复此过程骨骼肌背5至6段。相同的大口径吸管是用来同时删除两个高腹侧肌肉层，以获得目标快速骨骼肌。
9. 这样就完成了配对录音的准备和显微镜的放大是增加了约1.6倍。

2。第电机神经元和目标肌肉细胞配对录音

1. 清洗段进行扫描，找到第神经元。每个半段脊髓包含一个大的，10微米直径，第电机神经元。这泪滴形SOMA位于脊髓硬膜下表面附近的段边界的最尾结束。一个CAP神经元是选择录制，并在相邻的尾鳍段腹目标肌肉扫描检查完整性。
2. 两个补丁电极定位录音，神经和肌肉的第二次。上电极有一个强硬脊髓硬膜和小费约2微米的开放渗透浅的锥度。下电极具有低电阻电压钳记录骨骼肌陡峭的锥形
3. 神经元的电极定位在一个约30度，渗透到脊髓硬膜的角度，约一个半段到选定的第神经元延髓。提前使用轴驱动器的操纵者，而申请温柔的持续正压约60毫米汞电极。作为电极通过硬脑膜破裂，可能会流离失所第神经灌注电极，需要一个调整的重点。
4. 当电极接触的第神经元胞体的正压力释放，并立即形成一个gigaohm密封通常的结果。然而，在某些情况下，印章不能形成，就有必要申请一个温柔的负压。密封形成后，电极电位调整到具有80mV和应用负压破裂细胞膜。第神经元的特点是由140到180兆欧姆的输入电阻和一个动作电位，过冲40毫伏。这是由注入电流钳下逐步增加，直到引起动作电位的去极化步骤测试。
5. 接下来，在显微镜搬迁到腹侧肌，使用高功率下的XY的机动翻译。快肌细胞是选择目​​标字段。
6. 先进的肌肉电极对正压目标肌肉细胞，释放时，形成了一个gigaohm密封。电极电位调整到-50毫伏钠通道失活和温柔的吮吸下细胞膜破裂。一个在100至200兆欧姆电阻和突然出现的大电容瞬态信号输入的下降。
7. 为了测试配对记录，电机神经元去极化，直到动作电位引起的电流增量较大的注射。此时应引起肌肉终板电流。持续刺激motorneuron 1终板无故障电流的赫兹结果。由于刺激频率提高到100赫兹的终板电流波动幅度和接受刺激的10秒内功能枯竭。

3。代表性的成果

通常情况下，神经元的记录是稳定的，长达一小时，但肌肉细胞恶化反映作为一个串联电阻的增加。当发生这种情况的实验是终止或其他肌肉细胞是补丁夹住。所有记录应在一小时内完成。

图1。motorneuron动作电位（AP，顶部）和相关的肌肉终板电流（EPC，底部）的录音。过冲为第神经元动作电位+40 mV和EPC的上升在1毫秒的时间常数的指数时间当然沿300微秒内和腐烂。

名称	配方
沐浴液（毫米）	134氯化钠，氯化钾2.9，2.1 1.2 10氯化镁2，葡萄糖，钠，HEPES 10，pH值7.8 2，氯化钙
液与Tricaine	液含0.02％tricaine
液与甲酰胺	沐浴液含2M甲酰胺
神经元的内部解决方案（毫米）	115 K -葡萄糖，氯化钾，15 2 MgCl 2的 ，10 K-HEPES，5 K - EGTA，4毫克+ - ATP，pH值7.2
肌肉内部解决方案（单位：毫米）	120氯化钾，10 K-HEPES，5 BAPTA，pH值7.4

表1。解决方案。

Discussion

我们一直在用斑马鱼配对录音“（温家宝和布雷姆，2005年），主要研究在高频刺激囊泡的释放和回收的过程。这个过程被打乱在蠕动，其中正常的突触传递的突变体被破坏，由于点突变在突触的关键组件。例如，基因突变，破坏突触后受体聚合（Ono 等人，2001年，2002年，2004年）和合成突触前发射机（王等人，2008年）在联合国协调游泳的结果。配对录音提供的信息，可以精确定位功能缺陷的根源，从而连接行为，遗传学和生理学。它现在应该有可能进一步解剖的基本瞬时表达的方式，在使用的第明智的促销员电机神经元突触传递的过程。显性阴性或变异的基因，这样可以明确表示，在这些神经元的行为和电生理后果确定。整个单元的配置提供额外的好处让与代理商的第SOMA透析可能改变囊泡循环，如梭菌毒素和钙缓冲区。由于SOMA和肌肉之间的短距离，扩散录音时限内应该发生。该制剂的潜力可挖才刚刚开始。鱼在这种突触的年龄和位置表浅的透明度，也便于使用光学工具（Fetcho和奥马利，1997年; Fetcho和Higashijima，2004年）。远藤和使用FM染料和遗传指标，如Synaptophluorin（李等人 ，2003年）的鱼类生活的胞外分泌的测量，我们一直非常成功。此外，荧光标记的毒素可用于标签活鱼（伊瓦涅斯，塔伦等 ，2004）的成像突触蛋白。鉴于这种准备的简单，它认为未来研究的巨大潜力。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pneumatic transducer tester	Fluke Biomedical	DPM1B
0.002 x 3 inch tungsten rod	A-M Systems	715000
Sylgard 184 Elastomer	Dow Corning		The thickness of application will affect the DIC optics