Summary
اليرقات الزرد تمثل نموذجا الفقاريات أول نظام للسماح في وقت واحد تسجيل المشبك التصحيح من العضلات والخلايا العصبية الحركية ، الهدف العمود الفقري والهيكل العظمي. هذا الفيديو يوضح الطرق المجهرية المستخدمة لتحديد سقف قطعي السيارات بين الخلايا العصبية والخلايا العضلية المستهدفة فضلا عن منهجيات للتسجيل من كل نوع من الخلايا.
Abstract
اليرقات الزرد تمثل نموذجا الفقاريات أول نظام للسماح في وقت واحد تسجيل المشبك التصحيح من العضلات والخلايا العصبية الحركية ، الهدف الشوكي. هذا هو نتيجة مباشرة لسهولة الوصول إلى كل أنواع الخلايا والقدرة على التمييز بصريا كاب القطعة ذات محرك واحد الخلايا العصبية على أساس الشكل والمكان. هذا الفيديو يوضح الطرق المجهرية المستخدمة لتحديد سقف السيارات بين الخلايا العصبية والخلايا العضلية المستهدفة فضلا عن منهجيات للتسجيل من كل نوع من الخلايا. وأكد التعرف على نوع الخلايا العصبية الحركية ، عن طريق ملء كاب صبغ أو بواسطة ميزات مثل الموجي البيوفيزيائية عمل محتمل وخلية المقاومة الإدخال. الخلايا العصبية الحركية ، تسجيلات مشاركة بشكل روتيني لمدة ساعة واحدة تسمح على المدى الطويل من تسجيلات مختلفة متعددة الخلايا العضلية المستهدفة. السيطرة على نمط إطلاق الخلايا العصبية الحركية ، يمكن الاعتماد على قياسات التردد انتقال متشابك عند تقاطع العصبية والعضلية. نظرا لكمي بحجم كبير وانخفاض مستوى الضجيج التي تقدمها كل خلية المشبك الجهد ، يمكن حل كل الأحداث وحدوية في العضلات. هذه الميزة تسمح دراسة خصائص متشابك الأساسية مثل خصائص الإصدار ، وإعادة تدوير الحويصلة ، وكذلك الاكتئاب متشابك والتيسير. درس المزايا التي يوفرها هذا الكسوف في السابق فيفو إعداد أنظمة النموذج العصبي العضلي حيث يتم تحفيز الخلايا العصبية الحركية في العادة ، من قبل أقطاب خارج الخلية والعضلات تكون كبيرة جدا بالنسبة لكامل الخلية المشبك التصحيح. إعداد الزرد غير قابلة للجمع بين التحليل الكهربية مع طائفة واسعة من الأساليب بما في ذلك خطوط المعدلة وراثيا ، ضربة قاضية morpholino ، والتدخل الدوائي في الجسم الحي والتصوير. هذه المناهج ، إلى جانب عدد متزايد من الأمراض العصبية والعضلية النماذج التي تقدمها الخطوط متحولة من الزرد ، وفتح الباب لفهم جديد للاضطرابات العصبية والعضلية البشرية.
Protocol
1. إعداد الأسماك لتسجيلات المقترنة
- قبل بداية الداخلي ، وإعداد خمسة حلول الرئيسية ، التي تشمل : حلول الحمام ، حمام مع حلول Tricaine (MS222) ، حلول للنوم مع Formamide ، نيورون الحل الداخلي والحل العضلات الداخلية.
- المقبل ، جمع اليرقات الزرد واحدة تتراوح أعمارهم من 72 إلى 96 ساعة ومكان في الحمام مع حلول Tricaine. في غضون دقيقة واحدة من التعرض للمخدر ، فإن الأسماك لا تستجيب للمس.
- ضع السمك على قمة من صحن من البلاستيك ، وباستخدام stereomicroscope ، قطع رأس بشفرة الحلاقة حافة مزدوجة.
- نقل الأسماك إلى حجرة زجاجية مغطاة تسجيل sylgard ومليئة الحل باث. أربط في نهاية كل طريق إدراج دبابيس التنغستن شحذ الكهربائي من خلال notochord.
- إنشاء رفرف الجلد قرب نهاية منقاري من الاسماك مع دبوس من شأنها أن توفر قبضة كافية لزوج من ملقط الغرامة. إزالة الجلد المغطي التي تجتاح انها بالقرب من دبوس منقاري مع زوج من ملقط الغرامة. قشر ببطء في اتجاه الذيلية لإزالة الجلد.
- علاج السمك مع ملل 3 من محلول حمام مع Formamide لمدة 3-5 دقائق لمنع تقلصات العضلات التي قد تتداخل مع التسجيلات. يغسل 5 مرات مع حلول الحمام العادي. إزالة جزء من الطبقة السطحية للعضلة أكثر من 5-6 عن طريق التخلص من القطع بلطف مع الجانب من دبوس التنغستن.
- نقل الأسماك إلى المجهر تستقيم يقع في قفص فاراداي لحماية الضوضاء الكهربائية. وقد تم تجهيز المجهر مع مرحلة ثابتة ، العمل الطويلة المسافة الهدف 40X والتكبير من 0.5 إلى 4x. هي التي شنت المجهر على الترجمة الآلية المرحلة XY من أجل التحضير لنقل بين الأعصاب والعضلات تحت السلطة العليا. استخدام البصريات الفرق المقابل تدخل يساعد على تصور الخلايا العصبية.
- تحت التكبير X 0.5 ، استخدام واسع يحمل 15 ميكرون ماصة لإزالة العضلة الفوقية وفضح الحبل الشوكي. يتم تطبيق الضغط السلبي من خلال حقنة سم 3 ويمكن التخلص منها تتم إزالة الخلايا العضلية واحدا تلو الآخر. ويتكرر هذا الإجراء لمدة 5 إلى 6 قطاعات من الظهرية العضلات والهيكل العظمي. يتم استخدام نفس واسعة تحمل ماصة لإزالة الجزء العلوي أيضا طبقتين من العضلات البطنية للحصول على الهدف الهيكل العظمي والعضلات بسرعة.
- هذا اكتمال الإعداد للتسجيلات إقران وزيادة تكبير المجهر ل1.6x تقريبا.
2. المقترنة تسجيلات كاب موتور ، والخلايا العضلية العصبية الهدف
- يتم فحص شرائح تنظيفها لتحديد موقع الخلايا العصبية CAP. كل نصفي جزء من الحبل الشوكي يحتوي على واحد كبير ، وقطره 10 ميكرون ، وكاب السيارات بين الخلايا العصبية. يقع هذا سوما دمعة شكل سطحي تحت الجافية الشوكي قرب نهاية الذيل أكثر من الحدود قطعي. كما يتم اختيار الخلايا العصبية كاب لتسجيل ويتم فحص العضلات البطنية الهدف في قطعة الذيلية المتاخمة للتحقق من سلامتها.
- يتم وضع أقطاب كهربائية لتسجيل التصحيح اثنين ، واحد لخلية عصبية والثانية للالعضلات. القطب العلوي لديها تفتق الضحلة للتغلغل الجافية الشوكي صعبة وغيض افتتاح ما يقرب من 2 ميكرون. القطب السفلي لديه انحدارا تفتق عن انخفاض المقاومة الجهد تسجيل المشبك من الهيكل العظمي والعضلات
- موقف القطب عصبون بزاوية 30 درجة تقريبا لاختراق الجافية في العمود الفقري ، على بعد حوالى نصف جزء منقاري للعصبون كاب المحدد. دفع الكهربائي باستخدام محرك محوري في حين تتلاعب تطبيق الضغط الايجابي المستمر لطيف من الزئبق حوالي 60 ملليمترا. كما القطب من خلال فواصل الجافية ، قد تكون الخلايا العصبية كاب النازحين من نضح من القطب ، الأمر الذي يتطلب إعادة تكييف التركيز.
- عندما يتم تحرير مسرى اللمسات الضغط كاب سوما عصبون نتائج ايجابية وعادة ما تكون في تشكيل الفوري لختم gigaohm. ومع ذلك ، في بعض الحالات حيث ختم فشل النموذج ، يصبح من الضروري تطبيق ضغط لطيف سلبية. بعد تشكيل الختم ، يتم ضبط المحتملة الكهربائي إلى 80mV وتطبيق الضغط السلبي تمزق غشاء الخلية. وتتميز الخلايا العصبية كاب من قبل المقاومة مدخلات 140-180 ميجا أوم وإمكانات العمل التي overshoots +40 بالميليفولت. يتم اختبار هذا عن طريق حقن زيادة تدريجية في إطار الخطوات depolarizing المشبك الحالي حتى يتم استخلاصها من إمكانات العمل.
- المقبل ، يتم نقل المجهر لالعضلات البطنية به المترجم بمحركات XY تحت السلطة العليا. يتم اختيار خلية عضلية سريعة من الميدان الهدف.
- متقدمة القطب العضلات نحو هدف الخلية العضلات تحت الضغط الايجابي ، والتي عندما أفرج عنهم ، يشكل ختم gigaohm. يتم ضبط المحتملة الكهربائي إلى -50 بالميليفولت إلى تعطيل قنوات الصوديوم وتحت مص لطيف هو تمزق في غشاء الخلية. انخفاض في المقاومة من 100 إلى 200 ميجا أوم والظهور المفاجئ لدخول بالسعة الكبيرة إشارات العابرين.
- لاختبارلتسجيل الاقتران ، والخلايا العصبية الحركية ، عن طريق الحقن هو استقطابها أكبر تدريجيا الحالية حتى يتم استخلاصها إمكانات العمل. عند هذه النقطة يجب أن تكون تيارا endplate أثارت في العضلات. استمرار تحفيز motorneuron في 1 نتائج هيرتز في التيارات endplate دون الفشل. كما زادت وتيرة التحفيز إلى 100 هيرتز التيارات endplate تتقلب في السعة والخضوع استنفاد الفنية في غضون 10 ثانية من التحفيز.
3. ممثل النتائج
عادة ، تسجيل عصبون مستقرة لمدة تصل إلى ساعة واحدة ولكن التدهور كما هو مبين في خلايا العضلات وزيادة في المقاومة السلسلة. عندما يحدث هذا يتم إنهاء إما تجربة أو خلية أخرى فرضت العضلات هو التصحيح. وينبغي الانتهاء من جميع التسجيلات في غضون ساعة واحدة.
الشكل 1. تسجيلات من إمكانات العمل motorneuron (أ ب ، أعلى) وendplate العضلات المرتبطة الحالية (EPC ، القاع). ينبغي أن إمكانات العمل لعصبون كاب التجاوز +40 بالسيارات وEPC ويجب أن ترتفع على مسافة 300 μsec والاضمحلال على طول دوام الأسي مع الوقت أقل من 1 مللي ثانية ثابتة.
| اسم | وصفة |
| الحل حمام (مم) | 134 كلوريد الصوديوم ، و 2.9 بوكل ، 2.1 CaCl 2 ، 1.2 MgCl 2 ، 10 الجلوكوز ، 10 نا HEPES ، ودرجة الحموضة 7.8 |
| الحل مع حمام Tricaine | محلول يحتوي على حمام tricaine 0.02 ٪ |
| الحل مع حمام Formamide | محلول يحتوي على حمام 2M formamide |
| عصبون الحل الداخلي (مم) | K - 115 غلوكونات ، 15 بوكل ، 2 MgCl 2 ، 10 K-HEPES ، 5 K - EGTA ، 4 ملغ ATP ، ودرجة الحموضة 7.2 |
| الحل العضلات الداخلية (مم) | 120 بوكل ، 10 K-HEPES ، 5 BAPTA ، ودرجة الحموضة 7.4 |
الجدول 1. حلول.
Discussion
لقد تم استخدام التسجيلات الزرد الاقتران (ون وبريم ، 2005) أساسا لدراسة عمليات الإفراج وإعادة تدوير حويصلة خلال التحفيز الترددات العالية. وتعطلت هذه العملية في المسوخ حركية فيها انتقال متشابك العادية للخطر بسبب الطفرات نقطة في متشابك المكونات الرئيسية. على سبيل المثال ، والطفرات التي تعطل الركام بعد المشبكي مستقبلات (أونو وآخرون ، 2001 ، 2002 ، 2004) والتوليف من قبل المشبكي الارسال (وانغ وآخرون ، 2008) نتيجة للامم المتحدة في منسقة السباحة. تسجيلات إقران تقديم المعلومات التي يمكن تحديد مصدر الخلل الوظيفي ، مما يربط السلوك وعلم الوراثة والفيزيولوجيا. ينبغي أن يكون من الممكن الآن لمزيد من عمليات تشريح الكامنة وراء انتقال متشابك من قبل وسائل التعبير عابر في الخلايا العصبية الحركية باستخدام كاب المروجين الحكيم. بهذه الطريقة يمكن أن تكون مهيمنة أو تحور جينات سلبية وأعرب تحديدا في هذه الخلايا العصبية وتحديد كل من العواقب السلوكية والكهربية. ميزة إضافية توفرها لتكوين خلية كاملة لغسيل الكلى يسمح سوما كاب مع العوامل التي يمكن أن يغير يحتمل حويصلة إعادة التدوير ، مثل السموم والمطثية مخازن الكالسيوم. نظرا لبعد المسافة القصيرة بين سوما والعضلات ، وتحدث كذلك ينبغي نشرها ضمن الإطار الزمني للتسجيلات. بدأت المحتملة لهذا الإعداد فقط لاستغلالها. شفافية من الأسماك في هذا الموقع العمر وسطحي من نقاط الاشتباك العصبي كما يسهل استخدام الأدوات البصرية (Fetcho وأومالي ، 1997 ؛ Fetcho وHigashijima ، 2004). كنا ناجحة جدا في قياس إندو وإيماس في الأسماك الحية باستخدام الأصباغ وزير الخارجية والمؤشرات الجينية مثل Synaptophluorin (لي وآخرون ، 2003). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفلورسنت السموم مترافق لتسمية البروتينات متشابك للتصوير الأسماك الحية (ايبانيز - Tallon وآخرون ، 2004). نظرا لبساطة هذا المستحضر أنه يحمل وعدا كبيرا للدراسة في المستقبل.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NS - 18205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical | DPM1B | |
| 0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems | 715000 | |
| Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning | The thickness of application will affect the DIC optics |
References
- Fetcho, J. R., O'Malley, D. Imaging neuronal networks in behaving animals. Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).
- Fetcho, J. R., S, H. igashijima Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish. Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).
- Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo. Neuron. 43, 305-311 (2004).
- Li, W., Ono, F., Brehm, P. Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors. J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).
- Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish. J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse. J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function. J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).
- Wang, M., Wen, H., Brehm, P. Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan. J Neurophysiol. , 100-104 (2008).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).
