Summary
Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Ziel-Skelettmuskel ermöglichen. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um eine segmentale CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren.
Abstract
Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Zielmuskel ermöglichen. Dies ist eine direkte Folge der Zugang zu beiden Zelltypen und die Fähigkeit zur visuellen Unterscheidung der einzelnen segmentalen CaP Motor-Neuron auf der Basis von Morphologie und Lage. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um einen CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren. Bezeichnung des CaP Motor-Neuron-Typs ist entweder Farbstoff Füllung oder durch die biophysikalischen Eigenschaften wie Aktionspotential Wellenform und Zelle Eingangswiderstand bestätigt. Motor-Neuron-Aufnahmen routinemäßig zuletzt für 1 Stunde ermöglichen, langfristige Aufzeichnungen aus mehreren unterschiedlichen Ziel Muskelzellen. Die Kontrolle über den Motor-Neuron feuern Muster ermöglicht Messungen der Frequenz-Abhängigkeit der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse. Aufgrund einer großen quantal Größe und der geringen Geräuschentwicklung gesamte Zellspannung Klammer vorgesehen, können alle an der einheitlichen Ereignisse im Muskel gelöst werden. Diese Funktion erlaubt Erforschung grundlegender synaptischen Eigenschaften wie Release-Eigenschaften, Vesikel-Recycling, sowie synaptische Depression und Erleichterung. Die Vorteile dieser in vivo Vorbereitung eclipse früheren neuromuskulären Modell angebotenen Systeme untersucht, wobei die Motor-Neuronen in der Regel durch extrazelluläre Elektroden stimuliert werden und die Muskeln sind zu groß für die gesamte Zelle Patch-Clamp. Der Zebrafisch Vorbereitung ist offen für die Kombination von elektrophysiologischen Analyse mit einer Vielzahl von Ansätzen, einschließlich transgenen Linien, Morpholino Knockdown, pharmakologische Intervention und in-vivo-Bildgebung. Diese Ansätze, verbunden mit der wachsenden Zahl von neuromuskulären Erkrankungen Modelle von mutierten Linien der Zebrafisch zur Verfügung gestellt, die Tür öffnen für ein neues Verständnis der menschlichen neuromuskulären Erkrankungen.
Protocol
1. Zubereitung von Fisch für gepaarte Recordings
- Vor Beginn des Verfahrens vorzubereiten fünf Lösungen, darunter: Bath Solution, Badlösung mit Tricaine (MS222), Bad-Lösung mit Formamid, Neuron Internal Solution und Muscle Internal Solution.
- Anschließend sammeln einen einzigen Larven Zebrafisch im Alter von 72 bis 96 Stunden und in Badlösung mit Tricaine. Innerhalb einer Minute Einwirkzeit des Anästhetikums, die Fische nicht auf Berührung reagieren.
- Den Fisch auf einer Plastikschale und mit einem Stereomikroskop, mit einem Doppel-Rasierklinge zu enthaupten.
- Übertragen Sie die Fische, um ein Glas Aufnahme Kammer mit Sylgard beschichtet und mit Badlösung. Befestigen Sie an jedem Ende durch Einsetzen elektrolytisch geschärften Wolfram Stifte durch die Chorda.
- Erstellen Sie einen Hautlappen am rostralen Ende des Fisches mit einer Nadel, die eine ausreichend Grip für ein Paar feine Pinzette zur Verfügung stellt. Entfernen Sie die darüber liegende Haut durch Greifen es in der Nähe des rostralen Stift mit einer feinen Pinzette. Peel langsam in die kaudale Richtung die Haut abziehen.
- Behandeln Sie den Fisch mit 3 ml Badlösung mit Formamid für 3-5 Minuten, um Muskelkontraktionen, die mit Aufnahmen stören könnte, zu blockieren. Wash 5 mal mit normalen Bad Solution. Nehmen Sie Teil der oberflächlichen Muskulatur über 5 bis 6 Segmente, indem Sie vorsichtig die Verschrottung mit der Seite eines Wolframstift.
- Übertragen Sie die Fische zu einem aufrechten Mikroskop in einen Faraday-Käfig, um elektrische Störungen zu schützen. Das Mikroskop ist mit einer festen Bühne ausgestattet, großer Arbeitsabstand 40x und Zoom von .5 bis 4x. Das Mikroskop befindet sich auf einem motorisierten XY-Übersetzung Bühne montiert, um die Vorbereitung zwischen Nerv und Muskel unter hoher Leistung zu bewegen. Der Einsatz von Differential-Interferenz-Kontrast-Optik trägt dazu bei, die Neuronen zu visualisieren.
- Unter 0,5 x-Zoom, verwenden Sie eine weite Bohrung 15-Mikrometer-Pipette darüberliegenden Muskel entfernen und setzen das Rückenmark. Negativer Druck wird durch eine 3 cc Einwegspritze und Muskelzellen angewendet werden entfernt eins nach dem anderen. Dieses Verfahren ist für 5 bis 6 dorsalen Segmente der Skelettmuskulatur wiederholt. Das gleiche weite Bohrung Pipette wird verwendet, um auch entfernen, die beiden oberen Schichten der ventralen Muskulatur zum Ziel schnell Skelettmuskulatur zu erhalten.
- Damit ist die Vorbereitung für gepaarte Aufnahmen und das Mikroskop Zoom ist auf ca. 1,6 erhöht.
2. Gepaart Recordings von CaP Motor-Neuron-und Target Muskelzellen
- Das gereinigte Segmente werden gescannt, um die CaP Neuronen zu finden. Jeder Hemi-Segment des Rückenmarks enthält einen großen, 10 Mikron Durchmesser, CaP Motor-Neuron. Diese Tropfenform Soma ist oberflächlich unter der spinalen Dura in der Nähe des kaudalen Endes der segmentalen Grenze entfernt. Ein CaP Neuron ist für die Aufnahme ausgewählt und das ventrale Zielmuskel in den angrenzenden kaudalen Segment gescannt wird, um die Integrität zu überprüfen.
- Zwei aufgesetzte Elektroden sind für die Aufnahme, einen für das Neuron und eine zweite für den Muskelaufbau positioniert. Die obere Elektrode hat eine flache Kegel für das Eindringen der harten spinalen Dura und Bahnöffnung von etwa 2 Mikrometer. Die untere Elektrode hat eine steilere Kegel für geringen Widerstand Voltage-Clamp-Aufzeichnung der Skelettmuskulatur
- Position des Neurons Elektrode in einem Winkel von etwa 30 Grad auf der spinalen Dura einzudringen, etwa ein halbes Segment rostral um den ausgewählten CaP Neurons. Schieben Sie die Elektrode mit einem axialen Manipulator, während eine sanfte kontinuierliche positive Druck von etwa 60 Millimeter Quecksilber. Da die Elektrode bricht durch die Dura, kann die Kappe Neuron durch die Perfusion von der Elektrode verschoben werden, erfordern eine Neujustierung des Fokus.
- Wenn die Elektrode berührt die CaP Neuron soma Überdruck freigesetzt und führt in der Regel sofortige Bildung eines Gigaohm Dichtung. Doch in einigen Fällen, wo eine Abdichtung versagt zu bilden, wird es notwendig, einen sanften Unterdruck anwenden. Nach Siegel Bildung ist das Elektrodenpotential angepasst, um-80mV und Anwendung von Unterdruck Brüche der Zellmembran. Die GAP-Neuron ist mit einem Eingangswiderstand von 140 bis 180 Mega-Ohm und ein Aktionspotential, dass Überschwinger 40 Millivolt aus. Dies ist durch die Injektion schrittweise Erhöhung depolarisierende Schritte unter Stromzange bis das Aktionspotential ausgelöst wird getestet.
- Als nächstes wird das Mikroskop auf ventralen Muskel mit dem XY motorisierten Übersetzer unter hohen Strom verlegt. Eine schnelle Muskelzelle wird aus dem Zielfeld ausgewählt.
- Der Muskel-Elektrode ist auf das Ziel Muskelzelle unter Überdruck, der beim Loslassen, bildet eine Gigaohm Dichtung fortgeschritten. Das Elektrodenpotential wird auf -50 Millivolt eingestellt Natrium-Kanäle inaktivieren und unter leichtem Saugen der Zellmembran ist gerissen. Ein Rückgang der Widerstand gegen die 100 bis 200 Mega-Ohm und das plötzliche Auftauchen der großen kapazitiven Transienten-Eintrag.
- Um zu testen,für gepaarte der Aufnahme wird die Motor-Neuron depolarisiert durch schrittweise größere Injektionen von Strom, bis ein Aktionspotential ausgelöst wird. An dieser Stelle eine Endplatte Strom sollte in der Muskulatur hervorgerufen werden. Fortsetzung Stimulation der Motoneuronen bei 1 Hertz Ergebnisse in Endplatte Ströme ohne Ausfall. Da die Reizfrequenz auf 100 Hertz erhöht wird die Endplatte Strömungen schwanken in Amplitude und unterziehen funktionalen Erschöpfung innerhalb von 10 Sekunden Stimulation.
3. Repräsentative Ergebnisse
Typischerweise ist das Neuron eine Aufnahmedauer von bis zu einer Stunde stabil, aber die Muskelzellen verschlechtern, da eine Erhöhung der Serienwiderstand wider. In diesem Fall wird der Versuch entweder beendet oder anderen Muskelzelle ist Patch gespannt. Alle Aufnahmen sollten innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein.
Abbildung 1. Recordings der Motoneuron Aktionspotential (AP, oben) und die damit verbundenen muskulären Endplatte aktuellen (EPC, unten). Die Aktion Potenzial für eine CaP Neuron sollte Überschwingen +40 mV und der EPC sollte innerhalb von 300 us und Verfall entlang einer exponentiellen Zeitverlauf mit einer Zeitkonstante unter 1 ms steigen.
| Name | Rezept |
| Bad Solution (in mM) | 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 10 Glucose, 10 Na-HEPES, pH 7,8 |
| Badlösung mit Tricaine | Bath Lösung mit 0,02% Tricaine |
| Badlösung mit Formamid | Bath Lösung mit 2M Formamid |
| Neuron Internal Solution (in mM) | 115 K-Gluconat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7,2 |
| Muscle Internal Solution (in mM) | 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4 |
Tabelle 1. Solutions.
Discussion
Wir verwenden Zebrafisch gepaart Aufnahmen (Wen und Brehm, 2005) hauptsächlich auf die Prozesse der Vesikelfreisetzung und Recycling bei hoher Frequenz Stimulation zu studieren. Dieser Prozess ist in Motilität Mutanten wobei normale synaptische Übertragung unterbrochen wird durch Punktmutationen in wichtigen synaptischen Komponenten beeinträchtigt. Zum Beispiel, Mutationen, die postsynaptische Rezeptor-Aggregate (Ono et al., 2001, 2002, 2004) und die Synthese von präsynaptischen Sender (Wang et al., 2008) führen in eine unkoordinierte Schwimmen stören. Gepaart Aufnahmen liefern die Informationen, die die Quelle der funktionellen Defekt lokalisieren kann, was eine Verknüpfung Verhalten, Genetik und Physiologie. Es sollte nun möglich sein, weitere sezieren die zugrunde liegenden Prozesse der synaptischen Übertragung durch transiente Expression in der GAP-Motor-Neuronen mit vernünftigen Promotoren. Auf diese Weise dominant negative oder mutierten Gene gezielt in diesen Neuronen exprimiert werden, und beide Verhaltens-und elektrophysiologischen Folgen bestimmt. Der zusätzliche Vorteil von der ganzen Zelle Konfiguration angeboten ermöglicht Dialyse des CaP Soma mit Substanzen, die potenziell verändern können Vesikel-Recycling, wie Clostridien-Toxine und Kalzium-Puffer. Aufgrund der kurzen Entfernung zwischen dem Soma und Muskeln, sollte Diffusion und treten innerhalb des Zeitrahmens von Aufnahmen. Das Potenzial dieses Präparats hat gerade erst begonnen erschlossen werden. Die Transparenz der Fische in diesem Alter und oberflächliche Lage der Synapsen erleichtert zudem die Anwendung der optischen Instrumente (Fetcho und O'Malley, 1997; Fetcho und Higashijima, 2004). Wir waren sehr erfolgreich bei der Messung von Endo-und Exozytose in lebenden Fischen mit FM-Farbstoffe und genetische Indikatoren wie Synaptophluorin (Li et al., 2003). Darüber hinaus können fluoreszierenden konjugierten Toxinen verwendet werden, um synaptische Proteine für die Bildgebung von lebenden Fischen (Ibanez-Tallon et al., 2004) zu kennzeichnen. Angesichts der Einfachheit dieser Vorbereitung ist es sehr vielversprechend für die Zukunft studieren.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Gefördert durch die NIH (NS-18205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical | DPM1B | |
| 0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems | 715000 | |
| Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning | The thickness of application will affect the DIC optics |
References
- Fetcho, J. R., O'Malley, D. Imaging neuronal networks in behaving animals. Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).
- Fetcho, J. R., S, H. igashijima Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish. Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).
- Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo. Neuron. 43, 305-311 (2004).
- Li, W., Ono, F., Brehm, P. Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors. J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).
- Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish. J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse. J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function. J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).
- Wang, M., Wen, H., Brehm, P. Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan. J Neurophysiol. , 100-104 (2008).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).
