Summary
הזחל דג הזברה לייצג את חוליות first מודל המערכת כדי לאפשר הקלטה סימולטני מהדק תיקון של שריר מוטורי עצבי היעד השדרה השלד. וידאו זה מדגים את שיטות מיקרוסקופיות משמש לזיהוי שווי סגמנטלי מוטורי עצבי שרירים תאים היעד, כמו גם מתודולוגיות עבור הקלטה של כל סוג תא.
Abstract
הזחל דג הזברה לייצג את חוליות first מודל המערכת כדי לאפשר הקלטה סימולטני מהדק תיקון של שריר מוטורי עצבי היעד השדרה. זוהי תוצאה ישירה של הנגישות לשני סוגי התאים ויכולת ראייה להבחין בין שווי סגמנטלי יחיד מוטורי עצבי על בסיס מורפולוגיה ומיקום. וידאו זה מדגים את שיטות מיקרוסקופיות משמש לזיהוי שווי מוטורי עצבי שרירים תאים היעד, כמו גם מתודולוגיות עבור הקלטה של כל סוג תא. זיהוי סוג שווי מנוע נוירון הוא אושר על ידי מילוי או צבע או על ידי תכונות biophysical כגון waveform פעולה פוטנציאליים קלט התנגדות התא. Motor-נוירון הקלטות האחרון שגרתי עבור שעה אחת המתיר לטווח ארוך הקלטות ממספר בתאי שריר שונים היעד. שליטה על דפוס מנוע הנוירון יורה מאפשרת מדידות של תלות בתדר השידור הסינפטי בצומת neuromuscular. בשל גודל quantal גדול ואת רעש נמוך מסופק על ידי מהדק מתח התא כולו, את כל האירועים יחידתי ניתן לפתור בשריר. תכונה זו מאפשרת לימוד של נכסים הסינפטי בסיסיים כגון תכונות שחרור, מיחזור שלפוחית, כמו גם דיכאון סיוע הסינפטי ו. היתרונות המוצעים על ידי זה in vivo הכנה ליקוי במערכות קודמות מודל neuromuscular למד שבהן מנוע הנוירונים מגורה בדרך כלל על ידי אלקטרודות תאי השרירים הם גדולים מדי עבור מהדק תא כל תיקון. הכנת דג הזברה ניתנת בשילוב ניתוח אלקטרו עם מגוון רחב של גישות כולל קווי מהונדס, מציאה morpholino, התערבות פרמקולוגית ו in vivo הדמיה. גישות אלה, יחד עם מספר גדל והולך של דגמים מחלה התוקפת מסופק על ידי קווי מוטציה של דג הזברה, לפתוח את הדלת הבנה חדשה של הפרעות neuromuscular האדם.
Protocol
1. הכנת דגים על הקלטות מותאמים
- לפני תחילת התהליך, להכין חמישה פתרונות מרכזיים, הכוללים: פתרון באת, באת עם פתרון Tricaine (MS222), פתרון אמבט עם לפוראמיד, פתרון Neuron פנימית פתרון שריר פנימי.
- בשלב הבא, לאסוף דג הזברה הזחל יחיד בין הגילאים 72-96 שעות במקום בפתרון אמבט עם Tricaine. בתוך דקה אחת של חשיפה לחומר ההרדמה, הדגים לא יגיב למגע.
- מניחים את הדג על גבי צלחת פלסטיק, באמצעות stereomicroscope, לערוף עם להב כפול קצה תער.
- מעבירים את הדגים אל חדר זכוכית הקלטה מצופה sylgard ומלא פתרון אמבט. הדקו בכל קצה על ידי החדרת סיכות טונגסטן חידד אלקטרוליטים דרך notochord.
- צור דש העור לקראת סוף מקורי של הדגים בסיכה שיספק אחיזה נאותה בזוג מלקחיים בסדר. הסר את העור המכסה על ידי מרתק זה ליד הסיכה מקורי עם זוג מלקחיים בסדר. פיל באיטיות לכיוון הזנב כדי להסיר את העור.
- פנקו את הדג עם 3 MLS הפתרון אמבט עם לפוראמיד במשך 3-5 דקות כדי לחסום התכווצויות שרירים שעלולים להפריע הקלטות. לשטוף 5 פעמים עם פתרון אמבטיה רגילה. הסרת חלק של השכבה השטחית של השריר מעל 5-6 פלחי ידי מבטל בעדינות עם הצד של סיכה טונגסטן.
- מעבירים את הדגים מיקרוסקופ זקוף ממוקם בתוך כלוב פאראדיי מגן רעש חשמלי. המיקרוסקופ מצויד במה קבועה, עבודה ארוכות אובייקטיבית המרחק 40X וזום של עד 0.5 4x. המיקרוסקופ הוא רכוב על הבמה תרגום ממונע XY כדי להזיז את ההכנה בין העצב לשריר תחת מתח גבוה. השימוש התערבות אופטיקה ההפרש בניגוד עוזר לדמיין את הנוירונים.
- תחת זום x 0.5, השתמש משעמם רחב 15 מיקרון פיפטה להסיר השריר המכסה ולחשוף את חוט השדרה. לחץ שלילי מיושם באמצעות מזרק 3 סמ"ק חד פעמיות לתאי שריר מוסרים אחד אחד. הליך זה חוזר על עצמו במשך 5 עד 6 קטעים הגבי של שרירי השלד. אותו נשא רחב פיפטה משמשת גם להסיר את העליונות שתי שכבות של שריר הגחון כדי להשיג שרירים מהירה היעד השלד.
- זה משלים את ההכנות הקלטות לזווג את הזום מיקרוסקופ גדל ל 1.6x כ.
2. הקלטות מותאמים שווי של נוירון מוטורי-שרירים תאים היעד
- קטעי לנקות נסרקים לאתר את הנוירונים שווי. כל חמי קטע של חוט השדרה מכיל אחד גדול, בקוטר של 10 מיקרון, שווי מוטורי עצבי. סומה זה בצורת דמעה ממוקם שטחי סמוך לסוף רוב הזנב של הגבול סגמנטלי תחת הדורה השדרה. נוירון כובע נבחר להקלטה השריר היעד הגחון במגזר הזנב סמוך נסרק כדי לבדוק תקינות.
- שתי אלקטרודות תיקון ממוקמים הקלטה, אחד עבור הנוירון ואת השני עבור השריר. האלקטרודה העליונה יש להתחדד רדוד עבור חדירת קשה בעמוד השדרה הדורה ופתיחת טיפ של כ 2 מיקרון. אלקטרודה נמוכה יש להתחדד תלול יותר עבור מתח נמוך הקלטה מהדק התנגדות של שריר השלד
- מיקום האלקטרודה נוירון בזווית של כ 30 מעלות לחדור הדורה השדרה, על אחד חצי קטע מקורי אל הנוירון שווי שנבחר. מראש את האלקטרודה באמצעות מניפולטור כונן צירית תוך החלת לחץ עדין חיובי מתמשך של כ 60 מ"מ כספית. כאשר האלקטרודה פורץ דורה, שווי הנוירון עשוי להיות שנעקרו על ידי זלוף מן האלקטרודה, הדורש הסתגלות של המוקד.
- כאשר האלקטרודה נוגעת הנוירון יתר לחץ סומה חיובי משתחרר, ובדרך כלל התוצאות במבנה מיידית של חותם gigaohm. עם זאת, בכמה מקרים בהם חותם נכשל הטופס, יהיה צורך להחיל לחץ שלילי עדין. לאחר היווצרות חותם, פוטנציאל אלקטרודה מותאם-80mV ויישום של לחץ שלילי נקרע קרום התא. הנוירון שווי מאופיין בהתנגדות קלט של 140-180 מגה אוהם ואת פוטנציאל פעולה overshoots 40 millivolts. זה נבדק על ידי הזרקת הדרגתי הגדלת צעדים depolarizing תחת מהדק הנוכחית עד פוטנציאל פעולה הוא עורר.
- בשלב הבא, המיקרוסקופ הוא הועבר אל שריר הגחון באמצעות מתורגמן ממונע XY תחת מתח גבוה. תא שריר מהר נבחר מתחום היעד.
- אלקטרודה השריר היא מתקדמת לכיוון תא המטרה שריר בלחץ חיובי, אשר כאשר שוחרר, טפסים חותם gigaohm. פוטנציאל אלקטרודה מותאם -50 millivolts להשבית תעלות נתרן תחת למצוץ עדין של קרום התא הוא מקרע. ירידה בהתנגדות 100-200 מגה אוהם ואת הופעתו הפתאומית של כניסת אותות קיבולי הארעיים גדול.
- כדי לבדוקהקלטה לזווג את מנוע נוירון הוא depolarized ידי זריקות באופן הדרגתי יותר של זרם עד פוטנציאל פעולה הוא עורר. בנקודה זו הנוכחית endplate צריך להיות שהושרו בשריר. גירוי המשך motorneuron ב 1 תוצאות הרץ בזרמי endplate ללא כשל. כאשר תדר הגירוי גדל ל 100 הרץ הזרמים endplate להשתנות ב משרעת ועוברים דלדול תפקודית תוך 10 שניות של גירוי.
3. נציג תוצאות
בדרך כלל, הקלטה נוירון הוא יציב עד שעה אחת אבל לתאי השריר להתדרדר לידי ביטוי כמו גידול התנגדות הסדרה. כאשר זה קורה הניסוי יסתיים או אחר תא שריר הוא הידק תיקון. כל הקלטות אמור להסתיים בתוך שעה אחת.
באיור 1. הקלטות של פוטנציאל הפעולה motorneuron (AP, למעלה) ואת endplate שרירים הקשורים הנוכחי (EPC, למטה). פוטנציאל פעולה של נוירון כובע 40 mV להחטיא את המטרה ואת EPC צריך צריך לעלות בתוך μsec 300 וריקבון בתוואי זמן מעריכי עם זמן קבוע תחת 1 msec.
| שם | מתכון |
| הפתרון Bath (מ"מ) | 134 NaCl, KCl 2.9, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 גלוקוז, 10 Na-HEPES, pH 7.8 |
| אמבט עם פתרון Tricaine | אמבט פתרון המכיל tricaine 0.02% |
| אמבט עם פתרון לפוראמיד | אמבט פתרון המכיל 2M לפוראמיד |
| Neuron פתרון פנימי (מ"מ) | 115 K-gluconate, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, ה-pH 7.2 |
| שרירים פתרון פנימי (מ"מ) | 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7.4 |
טבלה 1. Solutions.
Discussion
אנחנו משתמשים הקלטות לזווג דג הזברה (וון Brehm, 2005) בעיקר כדי ללמוד את תהליכי השחרור של שלפוחית ומיחזור במהלך גירוי בתדירות גבוהה. תהליך זה משתבש מוטנטים תנועתיות שבו בשידור סינפטי רגיל נפגעת עקב מוטציות נקודה רכיבים סינפטיים מפתח. כך, למשל, מוטציות לשבש אגרגטים קולטן postsynaptic (אונו et al. 2001, 2002, 2004) וסינתזה של משדר presynaptic (וואנג et al. 2008) לגרום שחייה בלתי מתואמת. הקלטות מותאמים מספקים את המידע שניתן לאתר את מקור הליקוי פונקציונלי, ובכך מקשרים, התנהגות בגנטיקה ופיזיולוגיה. עכשיו הוא צריך להיות אפשרי כדי להמשיך לנתח את התהליכים שבבסיס בשידור סינפטי באמצעות ביטוי חולף על שווי מנוע הנוירונים באמצעות מקדמי נבון. בדרך זו הגנים שלילי או מוטציה דומיננטית יכול לבוא לידי ביטוי במיוחד בנוירונים אלו הן השלכות התנהגותיות אלקטרו נקבע. יתרון נוסף שמציע תצורת התא כולו מאפשר דיאליזה של סומה שווי עם גורמים שעלולים לשנות מיחזור שלפוחית, כגון רעלים קלוסטרידיאל ו buffers סידן. בשל המרחק הקצר בין סומה ואת השרירים, דיפוזיה אמור להתרחש גם בתוך מסגרת הזמן של הקלטות. הפוטנציאל של הכנה זו החלה רק כדי להיות טפח. השקיפות של הדג במיקום גיל שטחית זו של סינפסות גם מקלה על השימוש בכלים אופטי (Fetcho ו אומאלי, 1997; Fetcho ו Higashijima, 2004). אנחנו כבר מאוד מוצלח מדידה של אנדו exocytosis בדגים החיים באמצעות צבעים FM ואינדיקטורים גנטי כגון Synaptophluorin (Li et al., 2003). בנוסף, רעלים פלורסנט מצומדות ניתן להשתמש בתווית חלבונים סינפטיים עבור הדמיה של דגים חיים (איבנז, טאלון et al. 2004). לאור פשטות ההכנה זה טומן בחובו הבטחה גדולה במחקר עתידי.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
שמומן על ידי NIH (NS-18205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical | DPM1B | |
| 0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems | 715000 | |
| Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning | The thickness of application will affect the DIC optics |
References
- Fetcho, J. R., O'Malley, D. Imaging neuronal networks in behaving animals. Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).
- Fetcho, J. R., S, H. igashijima Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish. Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).
- Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo. Neuron. 43, 305-311 (2004).
- Li, W., Ono, F., Brehm, P. Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors. J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).
- Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish. J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse. J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function. J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).
- Wang, M., Wen, H., Brehm, P. Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan. J Neurophysiol. , 100-104 (2008).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).
